江口蘿卜豬UCP2基因啟動子變異分析

吳雪 張繼 邱淦遠 劉鵬程 楊茂林 劉若余

摘要：【目的】研究江口蘿卜豬UCP2基因啟動子變異，并對其進行生物信息學分析，為江口蘿卜豬品種選育及開發利用提供理論依據。【方法】利用江口蘿卜豬基因組DNA構建混合DNA池，PCR產物直接測序后采用DNASTAR等生物軟件分析篩選出SNP位點，然后采用Neural Network Promoter Prediction、TFsitescan、WebGene等生物信息學分析軟件預測單核苷酸突變前后的UCP2基因啟動子核心區域、轉錄因子結合位點和CpG島。【結果】在江口蘿卜豬UCP2基因啟動子上共篩選到3個SNPs位點，分別是G-84>A、G-161>C和T-366>A。利用生物信息學分析軟件分析單核苷酸突變對UCP2基因啟動子核心區域、轉錄因子結合位點及CpG島的影響，結果發現，從江口蘿卜豬UCP2基因啟動子上篩選到的3個SNPs位點均不在預測到的啟動子核心區域，但靠近轉錄起始點;3個SNPs位點也不在預測得到的CpG島內，且不會影響UCP2基因啟動子的甲基化水平;3個SNPs位點能在不同程度上導致轉錄因子結合位點消失或產生新的轉錄因子結合位點，其中G-161>C突變對轉錄因子結合位點的影響最大。【結論】從江口蘿卜豬UCP2基因啟動子上篩選到3個SNPs位點，分別為G-84>A、G-161>C和T-366>A，雖然這3個SNPs位點均不在啟動子核心區域及CpG島內，但不同程度造成轉錄因子結合位點消失或產生，其中G-161>C的影響最大，可能是調控UCP2基因表達的重要功能突變位點。

關鍵詞： 江口蘿卜豬;UCP2基因;啟動子;SNP位點;生物信息學

中圖分類號： S828.89? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）10-2314-08

UCP2 gene promoter variation in Jiangkou Luobo pigs

WU Xue1， ZHANG Ji1， QIU Gan-yuan1， LIU Peng-cheng1，

YANG Mao-lin2， LIU Ruo-yu1*

（1College of Animal Sciences， Guizhou University/Key Laboratory of Animal Genetics， Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region （Guizhou University）， Ministry of Education， Guiyang? 550025， China; 2Science and Technology Bureau of Jiangkou County， Tongren， Guizhou? 554400， China）

Abstract：【Objective】The promoter variation of UCP2 gene in Jiangkou Luobo pigs was studied and bioinformatics analysis was conducted to provide reference for breeding and development of? Jiangkou Luobo pigs. 【Method】The genomic DNA of Jiangkou Luobo pigs were used to construct a mixed DNA pool. The SNPs sites were screened by PCR direct sequencing and analyzed by DNASTAR and other bioinformatics softwares like Neural Network Promoter Prediction， TFsitescan and WebGene which were used to predict the UCP2 gene core promoter before and after single nucleotide mutation region， transcription factor binding site and CpG island. 【Result】Three SNPs sites were screened in the UCP2 promoter region of Jiangkou Luobo pigs， which were G-84>A， G-161>C and T-366>A， respectively. Bioinformatics analysis software was used to analyze the effect of single nucleotide mutation on the core region of UCP2 gene promoter， transcription factor binding site and CpG island in Jiangkou Luobo pigs. It was demonstrated that the three SNPs sites were not located in the core promoter regions predicted but close to the transcription start site by many kinds of software. The three SNPs were not existed in the predicted CpG island and did not affect the methylation level of the UCP2 promoter region. The three SNPs could cause the transcription factor binding site to disappear or produce a new transcription factor binding site in which the G-161>C mutation had the greatest effect on the transcription factor binding site. 【Conclusion】Three SNPs are screened from the promoter of UCP2 gene in Jiangkou Luobo pigs， which are G-84>A， G-161>C and T-366>A， respectively. Although these three SNPs are not in the core promoter region and the CpG island， but can lead to the transcription factor binding site disappear or produce， and G-161>C has the greatest influence， which may be an important functional mutation site regulating gene expression.

Key words： Jiangkou Luobo pig; UCP2 gene; promoter; SNP site; bioinformatics

0 引言

【研究意義】江口蘿卜豬是在貴州特殊自然環境下選育獲得的優良地方豬品種，是我國地方豬種遺傳資源保護品種之一，主要分布在貴州銅仁市江口縣及其毗鄰的松桃和碧江等縣。江口蘿卜豬具有早熟易肥、皮薄骨細及肉味香濃等特點，深受當地群眾的喜愛;但同時存在生長緩慢和瘦肉率低等缺陷（惠嫣婷等，2014）。解耦聯蛋白（Uncoupling protein，UCPs）是線粒體陰離子轉運家族（Mitochondrial anion carrier family，MACF）成員（Pennacchio et al.，2001，2002），UCPs家族共有6個成員，分別是UCP1、UCP2、UCP3、UCP4、UCP5和UCP6（Sokolova and Sokolov，2005）。UCPs是一種線粒體內膜蛋白，其主要功能是在氧化磷酸化過程中發揮解耦聯作用，能以質子漏方式實現氧化磷酸化電子傳遞過程中的質子回流，可降低質子電化學梯度（Ricquier and Bouilaud，2000），使呼吸鏈與腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）合成過程解耦聯，進而致使氧化磷酸化合成ATP的效率下降，以熱能的形式散發能量（張雷等，2010）。可見，UCPs對氧化磷酸化反應是生成ATP還是產熱散能具有決定性作用（陳亦婷和曾其毅，2016），因此，深入研究UCPs基因家族的調控機制有利于揭示其在畜禽生長發育過程中的功能作用。【前人研究進展】UCP2是至今發現對動物能量代謝具有最直接影響的功能蛋白，且不同于UCPs家族中的其他蛋白，其廣泛分布于動物的各種組織器官中，如白色脂肪組織、中樞神經系統及骨骼肌等（周輝和張旭家，2008）。UCP2可調節ATP的合成而減少活性氧生成。已有研究證實，UCP2基因在β細胞上調表達的同時伴有β細胞內ATP儲備減少現象（Chan et al.，2001），且局部的解耦聯可降低線粒體內NADH/煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NAD）的比例，加快底物氧化，進而促使底物氧化還原反應過程中產生的活性氧減少（Echtay et al.，2001）。Brand和Esteves（2005）研究表明，UCP2通過降低ATP/ADP比例而抑制鈣離子內流，從而減少葡萄糖對胰島素分泌的刺激作用，最終負向調節胰島素分泌。UCP2基因在多個組織器官中均有表達，除在β細胞中對胰島素分泌起負調節作用外，在脂肪酸代謝中也發揮著負調節作用（Liu et al.，2013）。由于UCP2基因在能量平衡、脂肪代謝及體重調節方面均發揮著重要作用，因此與動物的生長發育密切相關。Sherman等（2008）研究表明，肉牛UCP2基因外顯子和內含子上的突變與瘦肉量、干物質采食量和背膘厚相關;陳翠等（2012）研究發現，西門塔爾牛UCP2基因上的C161T和C305T兩個SNPs位點與其飼料轉化率、平均日增重、胸圍和腹圍顯著相關;劉文超（2014）研究發現，UCP2基因c.72G>A位點與家兔的生長性狀、屠體性狀及部分肉質性狀間存在關聯性;蔣秋斐等（2016）研究發現，UCP2基因第一外顯子SNP位點T632C對西門塔爾牛各生長性狀存在顯著效應，且AA基因型可作為后期品種選育的目的基因型;Wang等（2016）通過對441頭秦川牛進行直接測序分析，結果發現UCP2基因5'UTR區（SNP1：g.C-754G）的一個單核苷酸多態性與其背脂肪厚度、腰肌面積和肌內脂肪含量等肉質性狀相關;張娟等（2018）通過研究黑安格斯牛UCP2基因多態性，并對其多態位點不同基因型和生長性狀進行關聯性分析，結果證實UCP2-655G>C位點對黑安格斯牛生長性狀無顯著影響。此外，劉建華等（2015）研究揭示了UCP2基因在綿羊脂肪組織中呈季節性表達差異。【本研究切入點】目前，針對豬UCP2基因的研究主要集中在特異組織或特定生理狀態下的表達規律及其調控等方面，且已證實豬UCP2基因在不同品種間存在表達差異（Damon et al.，2000;Katsumata et al.，2004;Mostyn et al.，2004）。說明UCP2基因可能是影響畜禽生長性狀的主效基因或與主效基因緊密連鎖的標記基因，但國內有關UCP2基因的研究主要集中在牛和羊等動物上，在豬上的研究報道甚少。【擬解決的關鍵問題】以UCP2基因為目的基因，提取基因組DNA并構建江口蘿卜豬DNA池，直接測序后采用DNASTAR等生物軟件分析篩選出SNP位點，并對其突變前后的啟動子進行生物信息學分析，預測單核苷酸突變對UCP2基因啟動子核心區域、轉錄因子結合位點和CpG島的影響，為江口蘿卜豬品種選育及開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

56份江口蘿卜豬耳組織樣品均采自貴州省江口縣，采用Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]提取其基因組DNA。基因組DNA濃度使用NanoDrop 2000超微量紫外分光光度計進行測量，重復3次，取平均值;然后以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果，并將所有樣本DNA濃度調至100 ng/μL，各取5.0 μL混合，構建DNA池，4 ℃冰箱保存備用。

1. 2 引物設計合成及DNA擴增

參考豬UCP2基因DNA序列（GenBank登錄號NC_010451.4），利用Primer Premier 5.0設計2對特異性引物（表1），擴增外顯子上游2000 bp啟動子序列（圖1）;引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應體系20.0 μL：DNA模板2.0 μL，2×Taq PCR Master Mix 10.0 μL，上、下游引物（10 pmol/μL）各2.0 μL，ddH2O 4.0 μL。擴增程序：95.0 ℃預變性5 min;95.0 ℃ 30 s，退火溫度退火30 s，72.0 ℃ 30 s，進行35個循環;72.0 ℃延伸10 min。PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳后采用熒光成像系統進行觀察拍照。取電泳條帶單一、特異性好且無拖帶的PCR擴增產物送至北京諾賽基因組研究中心有限公司進行雙向測序。

1. 3 序列分析

測序結果采用DNASTAR中的SeqMan分析測序峰圖，并結合MegAlign和BLAST與參考序列進行序列比對分析，篩選出SNP位點。

1. 4 生物信息學分析

將江口蘿卜豬UCP2基因突變前后的序列提交至相關在線軟件進行比對分析，盡可能提高預測結果的準確性。采用Neural Network Promoter Prediction、Promoter 2.0和Promoter SCAN進行啟動子核心區域預測，使用TFsitescan、Ali Baba 2.1和LASAGNA-Searching 2.0進行轉錄因子結合位點預測，運用WebGene、MethPrimer、EMBOSS Cpgplot及Soft-berry進行CpG島預測。各在線分析軟件的網址詳見表2。

2 結果與分析

2. 1 PCR擴增結果

由圖2可看出，PCR擴增產物的電泳條帶單一、明亮清晰、特異性良好，且無雜帶、無拖帶等情況，與預期結果相符，可用于直接測序。

2. 2 測序分析結果

選取電泳條帶單一、特異性好且無拖帶的PCR擴增產物送至北京諾賽基因組研究中心有限公司進行雙向測序，通過DNASTAR和BLAST等分析軟件與參考序列進行比對分析，結果發現其與GenBank已公布的豬UCP2基因序列吻合，即確定為豬UCP2基因序列。將所得序列與參考序列進行比對分析，篩選出3個SNPs位點（圖3）。以UCP2基因第一外顯子第1位堿基位定義為+1，3個SNPs位點分別為G-84>A、G-161>C和T-366>A。

2. 3 UCP2基因啟動子核心區域預測結果

采用3種不同的生物信息學分析軟件對江口蘿卜豬UCP2基因調控序列啟動子進行預測，然后選取評分最高的預測結果（表3）。Neural Network Promoter Prediction預測發現存在4個可能的啟動子核心區域，評分均在0.80以上，其中-1745～-1695 bp的評分達0.96。Promoter 2.0預測結果評分均較低，最高為0.71，啟動子核心區域起始位點為-1600 bp。Promoter SCAN預測到1個啟動子核心區域，位于 -1273～-1023 bp處。測序發現的3個SNPs位點均未在預測的啟動子核心區域內，但這3個SNPs位點靠近轉錄起始點，因此是否在UCP2基因的表達調控中發揮重要作用還需進一步探究。

2. 4 UCP2基因啟動子區轉錄因子結合位點預測結果

利用3種不同的生物信息學分析軟件對江口蘿卜豬UCP2基因啟動子突變前后的轉錄因子結合位點進行預測，具體預測結果詳見表4。其中，TFsitescan預測發現，T-366>A突變會導致-370 bp處有1個轉錄因子結合位點消失，G-161>C突變會導致-166 bp和 -164 bp處2個新的轉錄因子結合位點產生;AliBaba 2.1預測發現，3個SNPs位點的突變會導致1個轉錄因子結合位點改變，并產生5個新的結合位點（圖4）;LASAGNA-Searching 2.0預測發現，3個SNPs位點的突變會導致1個高分結合位點消失、3個高分結合位點產生。說明從江口蘿卜豬UCP2啟動子上篩選到的3個SNPs位點均能不同程度地造成轉錄因子結合位點改變，促使UCP2基因轉錄因子結合效率增高。

2. 5 UCP2基因啟動子CpG島預測結果

以Obs/Exp值大于0.6，GC含量大于50.0%和CpG島范圍大于200 bp為標準，采用Webgene、MethPrimer、EMBOSS Cpgplot和Softberry等4種不同的生物信息學軟件預測江口蘿卜豬UCP2基因啟動子突變前后的CpG島，均發現有CpG島存在（表5）。其中，MethPrimer和EMBOSS Cpgplot的預測結果一致，在相同位置（-1476～-1264 bp和-1164～-698 bp）發現2個CpG島（圖5）。雖然4個生物信息學分析軟件所預測到的CpG島大小和位置不完全相同，但在-1200～ -700 bp的區域內4個生物信息學分析軟件的預測結果均表明極有可能存在1個CpG島。從江口蘿卜豬UCP2啟動子上篩選到的3個SNPs位點均不在預測得到的CpG島內，且不會影響UCP2基因啟動子的甲基化水平，說明SNP位點以此調控基因表達的可能性較小。

3 討論

啟動子是決定基因活動的開關，但同時受各種轉錄因子及甲基化水平等因素的調節。當葡萄糖含量增加時，通過不同轉錄因子（PPARs和SREBP1c）和核因子（HNF和C/EBPβ）可促進UCP2基因mRNA的表達（Chan and Harper，2006）。UCP2通過氧化磷酸化的解耦聯作用而調節ATP合成，限制活性氧產生，進而調節胰島素的分泌及脂肪酸的氧化，廣泛參與生物體的生長發育調控。Yu等（2005）研究表明，UCP2基因啟動子-886 bp處的G/A單核苷酸多態性可調節胰腺β細胞和脂肪細胞中UCP2基因的表達，從而影響血漿中甘油三酯和膽固醇的水平，即與人類的糖尿病和肥胖癥有密切關系。目前，在畜禽品種上針對UCP2基因的研究主要集中在外顯子變異上。李維等（2015）以比利時兔、加利福尼亞兔和新西蘭兔為研究對象，從第三外顯子上篩選到1個錯義突變Exon3-A63>C，并證實該突變會導致基因編碼mRNA二級結構及其蛋白二、三級結構改變。蔣秋斐等（2016）在寧夏西門塔爾雜種牛群體UCP2基因第一外顯子中檢測到3個SNPs位點，且發現AA基因型個體在不同月齡體高、胸圍顯著或極顯著高于BB基因型。本研究通過混合DNA池測序的方法，從江口蘿卜豬UCP2基因啟動子序列上篩選得到3個SNPs位點，均屬首次在江口蘿卜豬上獲得，因此是否在不同豬種中普遍存在尚需進一步探究驗證。

啟動子核心區采用不同生物信息學分析軟件預測其結果也不同。本研究為了最大程度地提高預測準確性，選取了多個預測結果較可信的軟件預測江口蘿卜豬UCP2基因啟動子核心區域，但本研究篩選得到的3個SNPs位點均不在預測所得的啟動子核心區域內，說明這些SNPs位點通過影響核心調控元件而調控基因表達的可能性較小。這3個SNPs位點對轉錄因子結合位點影響較大，能在不同程度上導致轉錄因子結合位點消失或產生新的轉錄因子結合位點，其中G-161>C突變對轉錄因子結合位點的影響最大，說明該突變可能通過影響轉錄因子結合位點而影響UCP2基因的表達。此外，Webgene等生物信息學分析軟件均能在江口蘿卜豬UCP2基因啟動子上預測到不同大小的CpG島，雖然不同生物信息學分析軟件的預測結果不完全相同，但均包含 -1200～-700 bp區域內的一段序列，說明此區域很有可能是1個CpG島，UCP2基因通過甲基化水平調節基因表達的可能性較大。在從江口蘿卜豬UCP2啟動子上篩選到的3個SNPs位點中，G-161>C可能是重要的功能突變位點，其對UCP2基因啟動子的影響最大，但對UCP2基因表達的影響還需進一步研究驗證。

4 結論

從江口蘿卜豬UCP2基因啟動子上篩選到3個SNPs位點，分別為G-84>A、G-161>C和T-366>A，雖然這3個SNPs位點均不在啟動子核心區域及CpG島內，但不同程度造成轉錄因子結合位點消失或產生，其中G-161>C的影響最大，可能是調控UCP2基因表達的重要功能突變位點。

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（責任編輯 蘭宗寶）