糖腎寧對高糖誘導的足細胞損傷模型Rho/ROCK通路的影響

徐嘉一 高彥彬 鄒大威 王曉磊 王濤 師一民 吳冰杰

摘要?目的：基于Rho/ROCK信號通路研究中藥糖腎寧對高糖誘導足細胞損傷模型的影響。方法：高糖培養足細胞，以不同藥物分組干預足細胞24 h，用羅丹明染色的鬼筆環肽法檢測足細胞骨架，細胞免疫熒光檢測足細胞標志蛋白Nephrin，Western Blotting檢測RhoA、ROCK1、Nephrin蛋白的表達。比較不同藥物或藥物濃度對高糖誘導足細胞損傷模型的影響。結果：糖腎寧可改善足細胞骨架結構，下調高糖誘導的足細胞損傷模型中異常升高的RhoA和ROCK1蛋白表達，上調Nephrin表達。結論：中藥糖腎寧可抑制高糖誘導的足細胞損傷模型RhoA/ROCK1信號通路，減輕足細胞骨架重構，改善足細胞損傷。

關鍵詞?中藥;糖腎寧;高糖;足細胞損傷;Rho/ROCK通路;實驗研究;足細胞標志蛋白;糖尿病腎病

Effects of Tangshenning on High Glucose-Induced Podocyte Injury Based on Rho/ROCK Pathway

Xu Jiayi1，2， Gao Yanbin1，2， Zou Dawei1，2， Wang Xiaolei1，2， Wang Tao1，2， Shi Yimin1，2， Wu Bingjie1，2

（1 School of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University， Beijing 100069， China; 2 Beijing Key Laboratory of TCM Collateral Disease Theory Research， Beijing 100069， China）

Abstract?Objective：To investigate the mechanism of traditional Chinese medicine Tangshenning on high glucose-induced podocyte injury based on Rho/ROCK signal pathway.Methods：Podocytes were cultured in high glucose.The podocytes were treated with different drugs for 24 h.The podocyte cytoskeleton was detected by rhodamine-stained phalloidin.The podocyte marker protein Nephrin was detected by immunofluorescence.Western blotting was used to detect RhoA， ROCK1 and Nephrin protein.Results：Tangshenning could improve the podocyte cytoskeleton， decreased expression of RhoA and ROCK1 protein， and increased expression of high glucose-induced Nephrin expression in high glucose-induced podocyte injury model.Conclusion：Traditional Chinese medicine Tangshenning can reduce the expression of RhoA/ROCK1 signaling pathway-related protein in high glucose cultured podocytes， reduce podocyte cytoskeletal remodeling， increase the expression of high glucose-induced Nephrin protein， and improve high glucose-induced podocyte injury.

Key Words?Traditional Chinese medicine;Tangshenning; High glucose; Podocyte; Rho/ROCK signal pathway;Experimental study; Podocyte marker protein; Diabetic Nephropathy

中圖分類號：R242;R587.1文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.12.014

糖尿病腎?。―iabetic Nephropathy，DN）是終末期腎病的最常見致病因素，在糖尿病患者中的發生率高達30%～40%，是糖尿病最嚴重的微血管并發癥之一，也是糖尿病致死的主要因素。DN臨床特征是進行性增加的蛋白尿，而足細胞功能障礙和形態學變化均可能導致腎小球濾過屏障功能受損，加重腎小球損傷，導致DN中蛋白尿的產生，足細胞損傷是糖尿病腎病腎小球損傷很關鍵的早期病理標記[1-3]。足細胞屬于終末分化的細胞，由胞體、主突和足突構成。足細胞與毛細血管內皮細胞和腎小球基膜一起構成腎小球血液濾過屏障，故糖尿病腎病中足突的融合和消失、足細胞骨架蛋白的缺失、足細胞數量改變及裂孔隔膜蛋白異常都將導致足細胞損傷，進一步加劇腎損傷[4-7]。研究發現高糖可誘導足細胞的細胞骨架重排，使足細胞足突回縮、融合和消失，足細胞脫落，導致足細胞形態和功能改變，加劇腎小球損傷和蛋白尿的產生。臨床實驗證實中藥糖腎寧在改善糖尿病腎病蛋白尿方面有非常顯著的療效[8]，而Rho/ROCK信號通路介導的細胞骨架重構作為治療糖尿病腎病的關鍵通路，在改善足細胞損傷和蛋白尿方面至關重要[9]。本研究將通過Rho/ROCK通路，進一步探討糖腎寧改善高糖誘導的足細胞損傷的作用機制?，F報道如下。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?細胞與動物?小鼠腎小球足細胞株購自北納創聯生物公司（批號：BNCC337685）;8周齡SPF級SD大鼠，雄性，30只，體質量（200±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可號：SCXK（京）2016-0006。倫理編號：AEEI-2017-039。

1.1.2?藥物?糖腎寧（成分：黃芪、金櫻子、大黃、川芎等，購自北京康仁堂藥業有限公司），纈沙坦膠囊（北京諾華制藥有限公司，生產批號：H20040217）。

1.1.3?試劑與儀器?DMEM低糖培養基（Gibco，10567014）;0.25%胰蛋白酶溶液（Gibco，25200056）;胎牛血清（依科賽，FSP500）;Nephrin抗體（Novus）;RhoA抗體（proteintech）;ROCK1抗體（proteintech）;羅丹明-鬼筆環肽（AAT）;甘露醇（Sigma）、葡萄糖（Sigma）。電泳儀和濕轉裝置（Bio-Rad，美國）;凝膠化學發光成像分析系統（VILBER LOURMAT，法國）;正置熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡（Leica，德國）;多功能基因蛋白檢測儀（SpectraMax iD3，奧地利）。

1.2?方法

1.2.1?含藥血清的制備?選取SPF級SD雄性大鼠30只，適應性喂養3 d后，隨機分空白組和糖腎寧組，糖腎寧組予中藥糖腎寧[20 g/（kg·d）]，空白組予生理鹽水，灌胃1次/d（2.25 mL/250 g），連續灌7 d。末次灌胃1 h后經腹主動脈取血，將采集的血液放在4 ℃中靜置過夜，以3 000 r/min，離心15 min，收集上清液，56 ℃水浴30 min滅活，經0.22 μm過濾器過濾除菌后，分裝，置于-80 ℃保存備用。

1.2.2?細胞培養?取對數生長期的細胞，用胰酶消化細胞，待細胞變圓回縮后，立即用含10%胎牛血清的DMEM培養基終止消化，收集細胞，1 000 r/min離心3 min，棄上清，加含10%胎牛血清的DMEM培養基5 mL于培養瓶中，置于5%CO2 33 ℃培養箱中增殖，每2 d換液，待細胞貼壁長至鋪滿培養瓶80%左右，1∶3傳代。取第4～5代細胞，放置在5%CO2 37 ℃培養箱中培養7～14 d后，足細胞分化成熟，將分化成熟的足細胞在無血清的低糖DMEM培養基中孵育24 h，進行不同分組的干預24 h。實驗分組為：正常組（NG，L-DMEM培養基+10%空白鼠血清）;甘露醇組（MG，L-DMEM培養基+24.5 mmol/L甘露醇+10%空白鼠血清）;模型組（HG，30 mmol/L葡萄糖的培養基+10%空白鼠血清）;糖腎寧低濃度組（LT，30 mmol/L葡萄糖的培養基+0.4%含藥血清+9.6%空白鼠血清）;糖腎寧中濃度組（MT，30 mmol/L葡萄糖的培養基+2%含藥血清+8%空白鼠血清）;糖腎寧高濃度組（HT，30 mmol/L葡萄糖的培養基+10%含藥血清）;纈沙坦組（XST，30 mmol/L葡萄糖的培養基+1 μmol/L纈沙坦+10%空白鼠血清）。

1.2.3?檢測方法

1.2.3.1?羅丹明-鬼筆環肽染色觀察細胞骨架?按實驗分組干預足細胞24 h，吸棄舊培養基，加入4%多聚甲醛溶液，常溫固定20 min，再加入PBS溶液稀釋的0.1%rtonX-100孵育10 min，分別加入100 μg/mL的羅丹明-鬼筆環肽工作液，錫紙覆蓋，常溫孵育1 h，再往每孔中滴加適量DAPI染液，孵育5 min，用抗熒光淬滅封片劑封于載玻片，激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.2.3.2?細胞免疫熒光檢測?按實驗分組干預足細胞24 h，用4%多聚甲醛溶液，室溫下固定15 min，再加入PBS溶液稀釋的0.5%Triton X-100，室溫孵育20 min后，向各孔中加入適量的10%正常山羊血清，常溫孵育30 min;吸水紙吸棄封閉山羊血清，不洗，加入稀釋好的一抗，放入濕盒，4 ℃孵育過夜，次日將一抗棄掉，滴加稀釋好的熒光二抗，放入濕盒，于37 ℃孵育1 h后，往各孔中滴加DAPI工作液，避光孵育10 min，用抗熒光淬滅封片劑封于載玻片，在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.3.3?Western Blot檢測?取分組干預后的細胞，加入適量的裂解液，提取細胞總蛋白，BCA測定蛋白濃度后加入上樣緩沖液，100 ℃金屬浴加熱10 min變性。吸取20 μg蛋白經電泳分離后轉膜至0.45 μm PVDF膜，用含5%脫脂牛奶的TBST封閉1 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，第2天TBST洗膜后加入相應的二抗，室溫震蕩1 h，TBST洗膜后加入現配置的ECL發光液，凝膠化學發光成像儀曝光，分析各蛋白表達水平。

1.3?統計學方法?采用SPSS Statistics 21統計軟件對研究數據進行統計分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗;計數資料用百分比（%）表示，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2?結果

2.1?糖腎寧對高糖誘導的足細胞損傷模型細胞骨架結構的影響?共聚焦顯微鏡觀察足細胞骨架顯示：NG組細胞骨架沿細胞長軸呈線性分布，骨架結構整齊清晰，足突明顯，熒光強度明亮。MG組與NG組相似。而HG組細胞皺縮，骨架結構斷裂，排列紊亂，熒光強度較NG組表達明顯暗淡。而LT、MT、HT組細胞骨架結構均明顯改善，熒光強度介于NG組和HG組之間，尤其HT組細胞骨架結構清晰，熒光強度較亮，足突明顯，而XST組細胞骨架熒光強度亮，骨架結構清楚，但足突不明顯。見圖1。

2.2?糖腎寧對高糖誘導的足細胞損傷模型Rho/ROCK信號通路的影響?Western blot結果顯示，MG組RhoA蛋白表達較NG組差異無統計學意義，HG組RhoA蛋白表達較NG組明顯升高（*P<0.05），而LT、MT、HT組和XST組RhoA蛋白表達較HG組明顯降低（△P<0.05），且LT、MT、HT組呈劑量依賴性下調異常升高的RhoA蛋白表達。MG組ROCK1蛋白表達與NG組比較差異無統計學意義（P>0.05），HG組ROCK1蛋白表達較NG組明顯升高（*P<0.05），而LT、MT、HT組和XST組ROCK1蛋白表達較HG組顯著降低（△P<0.05），且LT、MT、HT組呈劑量依賴性下調異常升高的ROCK1蛋白表達。見圖2。

2.3?糖腎寧對高糖誘導的足細胞損傷模型Nephrin蛋白表達的影響?Western blot結果顯示，MG組Nephrin蛋白表達與NG組比較差異無統計學意義（P>0.05），HG組Nephrin蛋白表達較NG組明顯降低（*P<0.05），而LT、MT、HT組和XST組Nephrin蛋白表達較HG組明顯升高（△P<0.05），且LT、MT、HT組呈劑量依賴性上調Nephrin表達。如圖3，細胞免疫熒光顯示，足細胞Nephrin蛋白主要在細胞質中表達，呈顆?；蚓€裝分布，NG組和MG組表達差異無統計學意義（P>0.05），HG組Nephrin蛋白表達量少，LT、MT、HT組Nephrin蛋白表達較HG組有明顯改善，其中HT組的熒光強度改善最為顯著，XST組Nephrin蛋白表達較HG組有明顯改善，蛋白表達趨勢與Western blot結果一致。見圖3。

3?討論

中醫認為糖尿病腎病是“消渴病”遷延日久，病久入絡，繼發于腎的腎絡受損疾病，故稱為“消渴病腎病”，國內學者多認為本病是以氣陰兩虛為本，痰濕、瘀血、濁毒等為標的虛實夾雜之證。高彥彬教授認為腎絡病變是貫穿糖尿病腎病始終的病理基礎，病變早期，腎氣不固，腎絡瘀滯;病變中期，陰損及陽，脾腎虛衰，腎絡瘀阻;病變晚期，腎絡瘀結，腎體勞衰。針對DN早期腎氣不固、腎絡瘀滯的病機特點，采用益氣固腎，化瘀通絡法獲得較好療效。臨床研究表明糖腎寧可降低早期糖尿病腎病患者血糖、血脂水平，改善血液流變學，抑制血小板聚集，降低早期DN患者異常升高的肌酐清除率，顯著減少微量蛋白尿，改善腎功能[8]。實驗研究證實糖腎寧可上調糖尿病大鼠降低的足細胞裂孔隔膜蛋白Nephrin，下調異常升高的足細胞骨架蛋白Desmin的表達，減少糖尿病腎病大鼠足細胞損傷，降低蛋白尿，保護腎功能[10]。

足細胞即腎小球上皮細胞，相鄰足細胞的足突互相交叉呈指嵌狀形成的裂孔隔膜，與腎小球基底膜和內皮細胞組成腎小球濾過屏障。足細胞屬于終末分化的細胞，在成人腎小球中進行細胞分裂的能力有限，足細胞肥大、足突融合、足細胞數量和密度降低、足細胞轉分化和足細胞凋亡等細胞結構和功能異常均會導致足細胞損傷，使足細胞功能喪失，濾過膜通透性增加，進而導致腎小球濾過屏障受損，發生蛋白尿。因此，足細胞損傷被認為是各種腎小球疾病的關鍵發病機制[11-14]。而足細胞具有復雜的肌動蛋白細胞骨架結構，足細胞損傷與足細胞骨架結構的穩定密切相關，細胞骨架的動態調節對裂孔隔膜和腎小球濾過屏障至關重要，足細胞骨架失調將直接影響足突，導致足細胞足突回縮、融合、消失[15]。本研究發現，與正常組比較，模型組足細胞足突消失，細胞骨架結構回縮、斷裂，排列紊亂，Nephrin蛋白表達顯著降低，而糖腎寧可改善高糖誘導的足細胞損傷模型的細胞骨架結構重構，上調Nephrin蛋白表達，改善足細胞損傷。

RhoA GTP酶屬于Ras超家族，是一類小GTP酶，可通過結合GDP和GTP起到分子開關的作用，Rho與GTP結合后，可激活下游Rho相關激酶（ROCK1）發生多個氨基酸位點的磷酸化。ROCK1是蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶，起到調節肌動球蛋白細胞骨架的作用。RhoA激活后，將活化ROCK1，并介導其下游一系列磷酸化/脫磷酸化反應，增強肌動-肌球蛋白收縮，通過控制肌動蛋白絲穩定、肌動蛋白網絡和肌動蛋白纖維組裝，誘導細胞骨架重構[16-20]。本研究發現，與正常組比較，模型組RhoA和ROCK1蛋白表達水平明顯升高，中藥糖腎寧可下調異常升高的RhoA和ROCK1蛋白表達水平，提示糖腎寧可通過抑制RhoA/ROCK1信號通路蛋白表達，穩定足細胞骨架調節，改善足細胞損傷。

綜上所述，本研究證實高糖可誘導足細胞Rho/ROCK信號通路激活，進而促進肌動蛋白收縮，以及細胞骨架重構，最終導致足細胞足突融合、消失等足細胞損傷。中藥糖腎寧可下調異常升高的RhoA、ROCK1蛋白表達，穩定足細胞骨架結構，上調Nephrin蛋白表達，減輕高糖誘導的足細胞損傷。我們認為糖腎寧減輕足細胞損傷的作用可能與抑制Rho/ROCK通路，減輕細胞骨架結構損傷有關，其具體作用機制仍需進一步開展深入研究。

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（2019-06-28收稿?責任編輯：王楊）