柴芩清熱口服液微生物限度檢查方法適用性試驗

王丹 裴斯彪 彭賢東 唐志立 郭廷東 潘良平

摘要?目的：建立柴芩清熱口服液微生物限度檢查方法，并對5個不同批次柴芩清熱口服液微生物限度進行適用性試驗。方法：根據2015版《中華人民共和國藥典》制備金黃色葡萄球菌菌液、枯草芽孢桿菌菌液、大腸埃希菌菌液、白色念珠菌菌液、黑曲霉菌液和銅綠假單胞菌菌液;而后采用氯化鈉胰蛋白胨稀釋液制得1∶10的柴芩清熱口服液供試品溶液;根據藥典中微生物限度檢查法，一步一步建立方法學，即進行計數方法適用性試驗和控制菌檢查試驗，并重復3次進行反復驗證，對柴芩清熱口服液中微生物的含量進行檢測。結果：1）需氧菌總數的計數中：采用薄膜過濾法微生物限度適用性試驗研究，柴芩清熱口服液需氧菌的菌株回收率計數試驗結果顯示：金黃色葡萄球菌、白色念球菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、銅綠假單胞菌的菌株回收率計數分別為1.02、0.99、0.84、0.96、0.99。2）霉菌和酵母菌計數中結果顯示，白色念珠菌和黑曲霉的菌株回收率分別是0.89和0.89。3）柴芩清熱口服液在常規法檢測控制菌適用性試驗結果中顯示，每1 g柴芩清熱口服液供試品中可能的菌數（102

關鍵詞?柴芩清熱口服液;薄膜過濾法;大腸埃希菌;金黃色葡萄球菌;白色念珠菌;黑曲霉;銅綠假單胞菌;枯草芽孢桿菌;微生物限度;適用性試驗

Applicability Test of Microbiological Limit Test Method for Chaiqin Qingre Oral Liquid

Wang Dan1，2， Pei Sibiao2， Peng Xiandong2， Tang Zhili2， Guo Tingdong2， Pan Liangping2

（1 Second Clinical Medical College， North Sichuan Medical College， Nanchong 637000， China; 2 Department of Pharmacy， Nanchong Central Hospital， Nanchong 637000， China）

Abstract?Objective：To establish a microbiological limit test method of Chaiqin Qingre Oral Liquid and to test the applicability of 5 different batches of Chaiqin Qingre Oral Liquid.Methods：Staphylococcus aureus， Bacillus subtilis， Escherichia coli， Candida albicans， Aspergillus Niger and Pseudomonas aeruginosa were prepared according to the 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia.Then the sample solution of Chaiqin Qingre oral liquid was prepared by sodium chloride tryptone dilution solution at 1：10.According to the microbial limit test method in Pharmacopoeia， the methodology was established step by step， that is， the applicability test of counting method and the test of control bacteria.The content of microorganism in Chaiqin Qingre oral liquid was detected by repeated verification for 3 times.Results：1）In the count of aerobic bacteria， the applicability test of microbial limit by membrane filtration was carried out.The results showed that the recovery rates of Staphylococcus aureus， Candida albicans， Bacillus subtilis， Aspergillus Niger and Pseudomonas aeruginosa were 1.02， 0.99， 0.84， 0.96， 0.99， respectively.2）The recovery rates of Candida albicans and Aspergillus Niger were 0.89 and 0.89， respectively.3）The results of the applicability test of Chaiqin Qingre oral liquid in the routine method showed that the possible number of bacteria per 1 g of Chaiqin Qingre oral liquid was（102

Key Words?Chaiqin Qingre oral liquid; Membrane filtration method; Escherichia coli; Staphylococcus aureus; Candida albicans; Aspergillus Niger; Pseudomonas aeruginosa; Bacillus subtilis; Microbial limit; Applicability test

中圖分類號：R286.0文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.12.009

柴芩清熱口服液我院的院內制劑，主要運用于上呼吸道感染的治療，患者多出現咳嗽流涕、咽痛鼻塞等癥狀，屬于中醫學中“風熱感冒”的范疇[1]，柴芩清熱口服液的主要藥物組成有山銀花、薄荷、法半夏、柴胡、連翹、蘆竹根、黃芩、青蒿、荊芥、板藍根等。制作成口服液的形式，主要是考到到患者服用時的便利性和便攜性。我國2015版《中華人民共和國藥典》對口服制劑的微生物限度要求為，所檢測樣品中細菌、霉菌、酵母菌的所有菌數總和必須低于10 cfu/mL，不得檢出大腸埃希菌和大腸菌群[2-3]，基于此，本研究就柴芩清熱口服液進行微生物限度檢查，采用薄膜過濾法入手對柴芩清熱口服液中白色念球菌、黑曲霉、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的驗證回收率進行展開研究，而后進一步以大腸埃希菌直接檢查法進行微生物限度適用性試驗研究。現具體報道如下。

1?儀器與試藥

1.1?儀器?蘇凈二級全排風生物安全柜（上海蘇凈實業有限公司，型號BSC-1600IIB2）;全封閉式集菌儀（上海喬躍電子有限公司，型號ZW-2008）;四川隔水式恒溫培養箱（成都市蘇凈科學器材有限公司，型號BG-80）;型霉菌培養箱（重慶市松朗電子儀器有限公司，型號JC-250F-I）。

1.2?試劑?MUG營養瓊脂培養基（NA-MUG，產品號：CM1517）、胰酪大豆胨培養基（產品號：CC-1411-25）和沙氏葡萄糖培養基（產品號：HB0110-6）購買于北京世紀奧科生物技術有限公司。改良馬丁培養基（青島海博生物有限公司，產品號：HB5222）;營養肉湯培養基（產品號：HB0108-4）、膽鹽乳糖培養基（產品號：PX010224）、營養瓊脂培養基（產品號：HB0109-7）和氯化鈉胰蛋白胨稀釋液（產品號：PX011018）購于北京譜析科技有限公司。

1.3?菌種?金黃色葡萄球菌菌株（產品號：PX50254）、枯草芽孢桿菌菌株（產品號：PX50222）、大腸埃希菌菌株[產品號：CM-CC（B）44102]、白色念珠菌菌株（產品號：PX50240）和黑曲霉菌株（產品號：PX50241）均購買于北京譜析科技有限公司;銅綠假單胞菌菌株[產品號：CMCC（B）10104]購買于中國食品藥品檢定研究院。

1.4?分析樣品?選擇5個不同批次的柴芩清熱口服液（川北醫學院附屬南充市中心醫院，批準文號：川藥制字Z20080285）。

2?方法

2.1?菌液的制備?1）所有菌液的制備均嚴格按照2015年版《中華人民共和國藥典》一部附錄重的具體要求進行操作[4-6]，其中金黃色葡萄球菌菌液、枯草芽孢桿菌菌液、大腸埃希菌菌液和銅綠假單胞菌菌液的制作均是，分別將金黃色葡萄球菌菌株、枯草芽孢桿菌菌株、大腸埃希菌菌株和銅綠假單胞菌菌株接種到胰酪大豆胨液體培養基中，經過24 h培養箱（30～35 ℃）的培養后，精密吸取1 mL菌懸液，并采用0.9無菌氯化鈉溶液將其配制成合適的菌懸液濃度。在控制菌驗證中中，在此基礎上制成菌懸液含有的菌落數均<100 cfu/mL。2）白色念珠菌菌液的制備是將白色念珠菌株接種到沙氏葡萄糖液體培養基中，經過2～3 d霉菌培養箱（20～25 ℃）的培養后，精密吸取1 mL菌懸液，并采用0.9無菌氯化鈉溶液將其配制成合適的菌懸液濃度。在控制菌驗證中中，在此基礎上制成菌懸液含有的菌落數均<100 cfu/mL。3）黑曲霉菌液的制備是將黑曲霉菌菌株接種到沙氏葡萄糖瓊脂培養基斜面上，經過5～7 d霉菌培養箱（20～25 ℃）的培養后，精密吸取1 mL菌懸液，并采用（0.9無菌氯化鈉溶液+0.05（v/v）吐溫80）將其配制成合適的菌懸液濃度。在控制菌驗證中中，在此基礎上制成菌懸液含有的菌落數均<100 cfu/mL。

2.2?供試品溶液的制備?首先將氯化鈉胰蛋白胨稀釋液調到pH值7.0時，精密量取柴芩清熱口服液10 mL，加入氯化鈉胰蛋白胨稀釋液至100 mL并劇烈振搖，重復混合均勻制得1∶10的柴芩清熱口服液供試品溶液。

2.3?柴芩清熱口服液計數方法適用性試驗

2.3.1?需氧菌總數的計數?采用薄膜過濾法將10 mL柴芩清熱口服液供試品溶液放入經滅菌后的試管中，加入0.1 mL相應的需氧菌試驗菌液，嚴格根據2015版《中華人民共和國藥典》使其終濃度的菌落數<100 cfu/mL，經過不斷吹打充分混合菌液后，取1 mL注入都100 mL無菌氯化鈉-蛋白胨（pH值7.0）中，通過緩慢濾過和多次粉刺沖洗抽干后，采用鑷子取膜，并輕貼于胰酪大豆胨瓊脂平板上，以倒置培養的方式進行培養，并測定菌落數。計數公式為：各菌株回收率=[（觀察組的菌落平均數-供試品對照組的菌落平均數）/菌液對照組的菌落平均數]。見表1。

2.3.2?霉菌和酵母菌的計數?將10 mL柴芩清熱口服液供試品溶液放入經滅菌后的試管中，加入0.1 mL相應的菌液，嚴格根據2015版《中華人民共和國藥典》[7]，使其終濃度的菌落數<100 cfu/mL，經過不斷吹打充分混合菌液后，取1 mL注入100 mL無菌氯化鈉-蛋白胨（pH值7.0）中，通過緩慢濾過和多次粉刺沖洗抽干后，采用鑷子取膜，并輕貼于沙氏葡萄糖瓊脂平板上，以20～25 ℃的培養溫度進行培養，并測定菌落數。計數公式為：各菌株回收率=[（觀察組的菌落平均數-供試品對照組的菌落平均數）/菌液對照組的菌落平均數]。見表2。

2.4?柴芩清熱口服液檢測控制菌試驗?根據控制菌檢驗方法[8-9]，首先采用移液管將10 mL柴芩清熱口服液供試品溶液放入經滅菌后的試管中，加入0.1 mL相應的大腸埃希菌菌液，使其終濃度的菌落數<100 cfu/mL，經過不斷吹打充分混合菌液后，取1 mL注入都100 mL胰酪大豆胨液體培養基中，并嚴格根據2015版《中華人民共和國藥典》[7]中控制菌檢驗方法檢查。見表3。

2.5?5個不同批次柴芩清熱口服液樣品檢測結果5批柴芩清熱口服液的微生物計數結果顯示需氧菌總數、霉菌總數和酵母菌總數均<10 cfu/mL，而在控制菌檢查試驗結果中5批柴芩清熱口服液中大腸埃希菌均未檢出。見表4、表5。

3?討論

柴芩清熱口服液處方中主要藥物組成為山銀花、薄荷、法半夏、柴胡、連翹、蘆竹根、黃芩、青蒿、荊芥、板藍根等;其中黃芩苷、連翹、柴胡和山銀花均具有較強的抑菌性，研究發現黃芩苷具有體外抑菌的作用[10-12]，該研究中主要選擇的菌種為金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、大腸桿菌、革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌等，結果發現黃芩苷對這些菌均有明顯的抑制作用，且對革蘭氏陽性菌的抗菌作用強于對革蘭氏陰性菌的抗菌作用;薄荷對霉菌具有明顯的抑制作用[13];而其中具有較強抗菌作用和較廣抗菌譜的當屬柴胡，研究發現[14-16]柴胡能夠有效抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和溶血性鏈球菌等，對痢疾桿菌和白色念珠菌也有一定的抗菌作用;山銀花具有抗病毒的作用，同時板藍根的抗菌研究中發現其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠膿桿菌均由不同程度的抑制作用[17-19]。雖然從柴芩清熱口服液的主要成分中可窺見其抑菌性，但仍必須按照《中華人民共和國藥典》有關規定要求進行微生物限度的適用性試驗，以科學的方法和態度保證柴芩清熱口服液藥物的安全性。

微生物限度檢查法在細菌計數試驗的過程中可能有明顯抑菌的品種，在控制菌的檢查過程中可以采用直接接種法、培養基稀釋法和薄膜過濾法，其中最為方便常用的直接接種法就能檢出試驗菌株，如果存在對抑菌活性較強而常規方法不能排除的制劑品種，則多選用薄膜過濾法。我們在柴芩清熱口服液微生物限度試驗研究過程中，在比較選用直接接種法、培養基稀釋法和薄膜過濾法進行了試驗，發現前2種試驗方法均存在干擾現象，而采用薄膜過濾法取得的測試結果干擾性較小，進一步加強了本研究結果的客觀性，為使本研究檢查結果獲得良好的

準確性和重復性，不僅保持等量的培養基注入體積，且均采用薄膜過濾法進行檢測和驗證，每次驗證需進行3次獨立完整的平行試驗。

為了減少微生物限度檢查中的干擾因素，故本研究采用逐層遞進的研究方法進行研究。首先采用的是需氧菌總數計數，菌株回收率計數試驗結果顯示：金黃色葡萄球菌、白色念球菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、銅綠假單胞菌的菌株回收率計數分別為1.02、0.99、0.84、0.96、0.99。緊接著對霉菌和酵母菌總數進行檢測，霉菌和酵母菌計數中結果顯示，白色念珠菌和黑曲霉的菌株回收率分別是0.89和0.89。值得注意的是，在2015版的《中華人民共和國藥典》中菌株回收率是用數值表示而不是百分比，藥典中規定回收值在0.5～2.0之間均屬于合格的范疇;這點有別于2010版《中華人民共和國藥典》，其采用的是百分比的形式來表示菌株回收率，并規定當菌株回收率不低于70%時才符合合格的標準。而在5個不同批次的柴芩清熱口服液需氧菌總數<10，符合2015版《中華人民共和國藥典》中<102的規定，5個不同批次柴芩清熱口服液霉菌和酵母菌總數均<10，也符合2015版《中華人民共和國藥典》中<101的規定;且5個不同批次柴芩清熱口服液中均未檢出大腸埃希菌。研究結果符合2015版《中華人民共和國藥典》對口服液制劑的微生物限度的規定。

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（2019-04-30收稿?責任編輯：王明）