牦牛高海拔下基因調控研究進展

馬秀梅 賀芷慧 田迷 汪喜衛 羅迅 趙永清 李貞子

摘要：牦牛生活于青藏高原草甸、荒漠等地，能較好的適應高海拔低氧環境。研究牦牛的高原低氧適應性特征對于畜牧業的生產，預防并治療高原病有重要的現實意義。近年，一些研究表明牦牛等高原世居動物體內存在著低氧適應相關基因，并在機體低氧適應的調控中起重要作用。該文就從一些低氧適應性相關基因的調控探討牦牛適應高海拔低氧環境的機理。

關鍵詞：牦牛;高海拔;低氧;適應性;基因

中圖分類號：S823 文獻標識碼：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.18.002

0 引言

牦牛別名旄牛，屬于草食性反芻動物，生活在海拔3000～5000m的青藏高原及比鄰地區，對高原特有的生態環境有極強的適應性，因而被稱為“高原之舟”。對于藏族人來說，牦牛有非常重要的作用。在高原地區，只有它可以較好地利用高原牧草資源并發揮動物性生產的主要作用。牦牛生存的地方熱輻射強，晝夜溫差大，氧分壓低，因此它對這種高原環境產生了自己的一套適應機制。近年，許多研究學者已經對牦牛適應高原低氧環境的機制展開了大量實驗探討，研究的主要是組織器官和分子機制。而有學者表示，高原哺乳動物適應低氧環境的機制主要是通過調控機體的細胞代謝以及相關的低氧適應基因來發揮作用，而并非僅靠機體器官。近年，國內外學者利用相關技術發現了30余種低氧適應的相關基因，發現這些基因主要是通過控制機體紅細胞生成、調節糖代謝以及促使血管生長和收縮等途徑來增強動物機體對氧氣的利用能力。因此該文從分子調控層面討論牦牛適應高海拔低氧的適應機制。

1 高原動物對低氧適應分子機制

1.1 血管內皮生長因子（VEGF）基因

血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），是一種糖蛋白，也是在體內誘導血管新生的主要作用因子。有關對牦牛肺血管內皮因子的研究發現，VEGF僅在肺泡壁有散在分布，正常氧濃度下VEGF表達量很低，起保持血管密度平衡的作用，缺氧時表達量會明顯升高，因為低氧時血管內皮細胞會通過分泌一些生長因子來控制平滑肌細胞和成纖維細胞的增殖和成長，對牦牛的發育會產生影響，并使牦牛肺的結構與低海拔地方的牛類有所不同，高原牦牛更能適應低氧環境。對高原牦牛以及高原黃牛的不同組織研究發現血管內皮生長因子-A基因蛋白的序列在牦牛和黃牛之間是相同的，但該基因的表達在牦牛的肺和胰腺中較高。由此可得出結論低氧適應可能與基因表達量有關，并且肺和脾是低氧適應調節的重要部位。

1.2 內皮PAS1蛋白（EPAS1）基因

內皮PAS1蛋白（EPAS1）又稱缺氧誘導因子2（hypoxia induced factor-2，HIF-2），主要分布于內皮細胞中，是細胞缺氧時的主要轉錄因子。大多數由低氧導致的酶的變動或因子均經過EPAS1發揮作用。各個組織器官之間的氧氣交換都與血管和紅細胞有關，有研究對高原土著人進行了全基因組等位基因分化掃描（GWADS），發現31個EPAS1 SNPs處于高度連鎖不平衡狀態，與血紅蛋白濃度顯著相關[1]。EPAS1是由HIF-2α和HIF-1β構成的異二聚體復合物。常氧下HIF-2α與VHL泛素2蛋白酶復合體在羥化后的ODD作用下經聯合，被泛素化，最后在蛋白水解酶作用下被降解，細胞內的EPAS1含量較低，而缺氧情況下此降解途徑會被抑制。有研究在牦牛的EPAS1基因中檢測到3個SNPs均處于高度連鎖狀態，認為EPAS1基因可作為耗牛適應高原低氧環境的分子信號。

1.3 促紅細胞生成素（EPO）基因

促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）是主要由腎臟合成的特異性糖蛋白激素。其可以結合紅細胞表面的EPO受體，在機體供氧不足情況下，EPO基因的mRNA表達水平顯著增加，紅細胞數也會增多。在骨髓造血微環境下，EPO基因促使紅細胞的生成與分化。EPO調控紅細胞數的主要作用因子是由低氧誘導生成的，而基因的3’非編碼區包括低氧誘導因子的應答元件。

高海拔和低海拔地區的牦牛與平原地區的黃牛相比，高海拔地區牦牛血液中低氧因子EPO含量相對較高[2]。用PCR-SSCP技術對牦牛促紅細胞生成素（EPO）基因進行了多態性分析檢測，發現了EPO基因中的AA，AB和BB3種基因型，會隨海拔的不同表現出差異。海拔升高，A等位基因頻率也升高，BB型的頻率則下降，而且群體雜合度和多態信息含量也會逐步下降，認為這種差異與牦牛對低氧產生適應性特征可能有關系[3]。

1.4 低氧誘導因子1（HIF-1）基因

低氧誘導因子1（Hypoxia inducible factor-1 alpha，HIF-1）是參與缺氧適應性反應中主要的蛋白轉錄調節因子，見表1[4]，具有DNA結合活性。

HIF-1是HIF-α和HIF-β2種亞基構成的異二聚體復合物，主要作用是調控組織和器官中氧的動態平衡。其中HIF-1α亞基包括HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α3種類型，這三者都受氧濃度影響，并且是調控HIF活性的功能性亞單位。而HIF-1β作為HIF的結構性亞基并不受氧濃度的影響。α和β亞基，都由bHLH（basichelix-loop-helix）、PAS（Per/Arnt/Sim）、ODD（oxygen-dependentdegradtion）和TAD（transactiva-tion domain）這4種結構域構成。許多研究表示HIF-1是平衡氧穩態和調節低氧反應的重要轉錄因子，其調節模式見圖2[5]。

注：VHL：腫瘤抑制蛋白，ODD：氧降解域，TAD：HIF-1α抑制性結構域，PHD：脯氨酸羥化酶，P300/CBP：共激活因子，FIH：HIF-1抑制因子，HREs：低氧應答元件，Proteasome：蛋白酶體。

在常氧下，PHD會催化HIF-1α的氧依賴性降解結構域（ODD）中特定的脯氨酞殘基的Fe（Ⅱ）依賴性，使其羥基化，進而HIF-1α亞基迅速結合VHL，VHL會靶向HIF-1α進行多泛素化并使其降解。HIF-1抑制因子（FIH）在常氧下會結合HIF-1α抑制性結構域（TAD）使其羥基化，抑制HIF-1α聯合P300/CBP，從而限制HIF轉錄活性;而在缺氧條件下，PHD沒有使HIF-1α羥基化的作用，HIF-1α會結合P300/CBP，并與HIF-β形成二聚體轉移到細胞核中作用于HREs，啟動缺氧轉錄程序，激活多種下游靶基因啟動子區的缺氧調節元件，引發組織細胞一系列低氧適應性反應。因此氧誘導因子是一種轉錄激活因子，在所有后生動物體內都起著調節氧穩態的主要作用。在常氧條件下，處于和成與降解過程，只有缺氧條件下才穩定表達。對青海牦牛HIF-1α基因的組織表達進行相關檢測[6]，發現HIF-1α基因在心、肝、肺、脾、腎、腦、肌肉、睪丸組織中均有表達，其中睪丸和脾中的表達量最高，肌肉中的表達量最低，此研究表明了HIF-1α在高原世居動物低氧適應的分子機制中有著重要的意義。

1.5 線粒體基因

線粒體作為一種半自主細胞器，本身具有遺傳物質和遺傳體系，它是生物體的能量來源，可以調控細胞的成長和細胞周期。線粒體內膜上含有參與各種氧化反應的酶類及轉運蛋白，在低氧適應的途徑中起重要作用。線粒體基因組包括編碼有些rRNA、tRNA基因以及13個編碼蛋白質的功能基因。這些基因的突變以及表達量變化會使細胞呼吸鏈效率發生變化，進而參與到機體低氧適應途徑中[7]。線粒體對缺氧反應很敏感，高原動物在缺氧情況下細胞中的線粒體會消耗并且電子傳遞鏈復合物降低，產生許多活性氧（reactive oxygen species，ROS）。而線粒體會通過自噬的方式減少ROS對細胞及機體正常代謝的影響，使生物適應高原低氧環境。

1.6 血紅蛋白（H6）基因

血紅蛋白是紅細胞內運輸氧的蛋白質，在高氧分壓下結合氧，低氧分壓下解離氧，為動物機體供應能量代謝所需的氧，血紅蛋白與氧結合特點對動物抵抗低氧的能力起重要的生理作用。高原世居動物是以改變細胞內Hb結構與功能來提高對氧的親和力。據研究測定，海拔4300m左右的青海瑪多牦牛的血紅蛋白顯著高于海拔3000m左右的西藏林芝地區的牦牛[8]。這表明海拔越高血液中的HB含量越多，進而使牦牛血液中氧容量增多，在正常呼吸情況下運輸更多的氧來適應低氧環境。

1.7 肌紅蛋白（Mb）基因

肌紅蛋白（Myoglobin，Mb）主要存在于哺乳動物肌細胞中，是儲存和調配氧的蛋白質。它由一條多肽鏈和一個輔基血紅素組成，在缺氧條件下機體會通過增加Mb含量來適應低氧環境。檢測高海拔地區動物心肌細胞的Mb發現其含量明顯升高，這有利于氧的運輸。據研究表明青海瑪多（4300m左右）牦牛的心肌和骨骼肌的Mb含量均高于青海循化（3500m左右）牦牛。

1.8 EGLN1基因

EGLN1（Egl nine homolog 1）又稱脯氨酰羥化酶2蛋白（Prolyl hydroxylase domain protein 2，PHD2），是PHD家族成員中的一種（PHD有四種，分別是PHD1，PHD2，PHD3和PHD4，前三種為關注熱點）。EGLN1基因是重要的氧傳感基因，也是HIF-1α信號通路的重要調控基因。有研究用生物信息學方法對哺乳動物EGLN1基因的適應性進化進行了分析，結果顯示EGLN1基因中檢測到正選擇位點，從而推斷出在進化中EGLN1基因受到正選擇作用，形成適應性進化（如低氧環境的適應性等）[9]檢測牦牛和黃牛心臟、肺臟、肝臟及大腦等器官中的EGLN1基因后，發現牦牛各器官中的EGLN1基因表達量均高于黃牛，且肝臟中的表達量最高[10]。這也可以說明EGLN1基因可作為研究低氧適應性的重要基因之一。

1.9 其他重要基因

熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）基因是一類使機體或細胞免受損害的熱應激蛋白質。在高原缺氧情況下HSP70會減弱細胞的下一次受損程度，維持細胞的正常生理機能。羥甲基膽素合酶（HMBS）基因，是編碼一系列羥甲基膽素合酶超家族中的一個成員。它編碼的蛋白質屬于細胞血紅素生物合成途徑的第三種酶，而血紅素是肌紅蛋白和血紅蛋白等的輔基。由此可認為HMBS基因的蛋白質在參與細胞血紅素生物合成途徑中也與低氧適應性有關。谷胱甘肽硫轉移酶（glutathione S-transferase，GST）基因，是一種擁有細胞解毒作用的蛋白質，主要分布在于細胞質中。GST是體內解毒酶系統的首要組成部分，在抗癌、解毒、保護機體細胞免受氧化損害中起重要作用。由于長期生活在高海拔地區容易使動物機體產生對細胞有損害的活性氧（ROS），而GST是可以清除活性氧的關鍵酶之一。

2 結論

低氧適應是機體在高原低氧，或者是在特殊情況下為維持機體正常功能，所產生的一種特殊的保護機制，其中低氧適應基因起主要調節作用。低氧適應基因是指在缺氧條件下能誘導低氧適應反應機制的基因群，這些基因可以調節紅細胞形成，血管生長，糖代謝和應激反應等生理性功能，進而促進機體氧的攝取量和利用率。綜合上述多個基因對低氧適應性調節的特點，無論是在細胞還是在機體的局部水平，HIF-1都是缺氧信號傳遞的重要樞紐，而HIF-1α被認為是細胞缺氧感應所必需的核心轉錄因子。高原動物對低氧環境在分子層面上做出的適應性和調控是極其復雜多樣的，機體對低氧基因表達的調控有待做深入研究。

3 結束語

長期生活在高海拔地域的動物對低氧環境已經具有良好的遺傳適應性。對高原動物如藏豬、藏獒、藏雞、耗牛及一些飛禽魚類等典型的耐低氧動物，展開低氧適應研究，并探討搜集低氧適應性基因，對于一些高原病的預防和診治，保存高原動物特色優良基因，培育高產耐低氧的畜禽品種有著重要的意義，同時也對人類及動物對低氧環境的征服做出貢獻。而目前關于高原低氧適應性的分子機制研究較少，處于發展水平，對很多機體的缺氧感受傳導途徑還不是很清楚。研究牦牛等高原世居動物的低氧適應性分子機制與生理機理，應從細胞、分子、代謝和基因組學等各方面進行深入、全面的整合分析，擴大基因組學的研究范圍，以期闡明其低氧適應在轉錄組、基因組及蛋白組綜合分析研究中的詳細機制。

參考文獻

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基金項目：中央高校基本科研業務.牦牛代謝特征及HIF對代謝調控關鍵酶影響的研究（項目編號：31920180131）;西北民族大學國家級大學生創新創業訓練計劃資助項目（項目編號：201910742095）

作者簡介：馬秀梅（1999-），女，東鄉族，甘肅康樂人，動物科學專業。

通信作者：趙永清（1979-），男，回族，甘肅天水人，博士，副教授，研究方向：動物低氧下的基因調控。

李貞子（1984-），女，畬族，浙江溫州人，碩士，高級實驗師，研究方向：畜產品加工。