利用微衛星標記和線粒體mtDNA D-loop區分析龍勝鳳雞遺傳多樣性

黃英飛 莫國東 吳強 孫俊麗 周志揚 萬火福 韋鳳英 廖玉英

摘要：試驗利用微衛星標記和線粒體mtDNA D-loop區分析龍勝鳳雞的遺傳多樣性及其品種資源的保種效果，進而更好的保護和利用。在龍勝鳳雞保種群中隨機抽取30只血樣，采用PCR和直接測序的方法測定mtDNA D-loop序列。結果表明：18對微衛星檢測中，龍勝鳳雞的多態信息含量PIC平均為0.5869，4個中度多態位點，14個高度多態位點;線粒體mtDNA D-loop區中，共發現9種單倍型，21個變異位點，變異方式主要是轉換，未發現缺失;核苷酸多樣度為（0.01129士0.00349），單倍型多態度為（0.5150±0.1110）;在NJ系統發生樹上，分為3大類群，則具有3個血統來源，結果顯示龍勝鳳雞具有比較豐富的遺傳多樣性和較低的變異程度，說明采用家系保種法對龍勝鳳雞進行保種，方法有效可行。

關鍵詞：龍勝鳳雞;微衛星;線粒體;保種效果

中圖分類號：S828 文獻標識碼：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.18.001

0 引言

龍勝鳳雞俗稱瑤山雞，因其鳳頭、羽色絢麗多彩而得名，喻有鳳凰之意。具有肉質鮮美、適應性和抗病力強，耐寒耐粗飼等優點，但有個子小、生長速度慢等缺點[1]。正是因為生長慢，龍勝鳳雞的飼養量不高，近年人為導人外來品種進行雜交改良，這給龍勝鳳雞這一優良品種帶來巨大的危害，嚴重可導致滅絕。因此，加強龍勝鳳雞遺傳資源保護研究對其種質資源保護和開發利用具有重要意義。

微衛星標記和線粒體分析是近年研究雞品種遺傳多樣性最常用的分子標記，具有多態性豐富、信息含量大、共顯性和保守性等特點，已成為研究群體遺傳結構和親緣關系的有效方法之一[2-4]。研究用微衛星和線粒體mtDNAD-loop序列對經過家系保種法保種的龍勝鳳雞進行遺傳多樣性分析，探討龍勝鳳雞現有品種的遺傳資源現狀及遺傳潛力，為地方雞品種的科學保護提供方法。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

自廣西桂林龍勝縣龍勝鳳雞保種場，隨機選擇30只核心群種雞，翅靜脈采血3mL，ACD抗凝，4℃保存備用。

1.2 DNA抽提和引物合成

利用北京康為世紀公司的血液基因組柱式小量提取試劑盒提取基因組。微衛星位點的選擇是根據FAO推薦的雞最新微衛星標記，選擇等位基因數多、多態性豐富的微衛星位點18對，引物詳情見表1，微衛星標記的上游引物5'端均用FAM熒光標記，以便對位點掃描分型;mtDNAD-loop高變區擴增引物序列：5’-ACCCATTATATGTATACGGGCATTAA-3’，5’-AGTTATGCATGGGATGTGCCTGACCGAG-3’，以上引物均由Invitrogen公司合成。

1.3 PCR擴增及測序

微衛星PCR反應體系：PCR mix 7.5μL，上下引物各1.0μmol/L，模板50ng，超純水補足15μL。反應條件：95℃3min：95℃，30s：50～65℃，30s：72℃，30s，35個循環;72℃8min;4℃保存。1.5%瓊脂糖檢測PCRr增產物，理想的PCR產物送Invitrogen公司進行基于片段掃描。

線粒體PCR反應體系：2×Taq PCR MasterMix試劑12.5 μL，上下游引物各1.0μmol/L，DNA樣品80ng，超純水不足25μL。反應條件：95℃，預變性5min;95℃變性30s;58℃退火30s：72℃延伸30s，35個循環：72℃延伸5min;4℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠檢測PCR產物。擴增產物經DNA快速回收試純化后，送北京華諾時代科技公司測序。

1.4 數據分析

微衛星：根據基因掃描圖，整理18對微衛星座位等位基因數據，利用POP32生物軟件進行分析，得到不同位點的等位基因數、有效等位基因數、雜合度、多態信息含量（PIC）。

線粒體：用DNAstar軟件包對所得序列進行核對和剪切，并分析其堿基含量，然后Clustal X軟件進行序列比對查找變異位點，再用DNASP 5.0軟件計算單倍型數目、單倍型多樣度、核苷酸多樣度和核苷酸平均差異數。最后用MEGA6.0軟件構建無根系統樹。

2 結果

2.1 微衛星標記位點結果

利用18對微衛星標記對龍勝鳳雞核心群分析共檢測到129個等位基因，每個位點的等位基因數3（MCW0103）～16（MCW0034）個，總群平均等位基因數及平均有效等位基因平均分別為5.56和3.18。18個位點除ADL0112、MCW0103、MCW0098、MCW0216位點外，其余的14個位點均有較高的雜合度及多態信息含量。總群的平均多態信息含量（PIC）和雜合度分別為0.5869、0.6490，均值都高于0.50，說明龍勝鳳雞保種群具有比較豐富的遺傳多樣性。見表1。

2.2 龍勝鳳雞mtDNA D-loop區序列遺傳多樣性

以GU261701作為參考序列進行比對分析，共確定9種單倍型，其中單倍型H3與參考序列GU261701一致。發現變異位點21個，占分析位點的6.56%，核苷酸位點發生變異主要是轉換，未發現缺失。核苷酸多樣性和單倍型多態性分別（0.01129±0.00349）、（0.5150±0.1110），說明現存的龍勝鳳雞核心群具有較高的遺傳資源多態性，見表2。

2.3 龍勝鳳雞遺傳分化

根據龍勝鳳雞的mtDNA D-loop區的9種單倍型序列，按鄰接法（NJ）的Kimura2 parameter模型構建NJ系統發生樹，見圖1。所檢測的30個龍勝鳳雞樣品的9種單倍型主要分成3個類群（B、C、E），B和C類群各含4種單倍型，E類群只有1種單倍型。

3 討論

多態信息含量（PIC）作為衡量基因片段多態性的指標，多態信息含量越大，提供的遺傳信息就越高（當PIC<0.25為底度多態位點;0.25

0.5為高度多態位點）[5]。線粒體DNA（mtDNA）是細胞質內的遺傳物質，具有分子結構簡單、含量豐富、群體內變化大等特點，并且能嚴格遵循母系遺傳，在傳遞中極少發生DNA重組，與核基因進化速度快及突變率高，可從母系起源上確定品種間的遺傳關系[6]。通過使用微衛星和mtDNA對龍勝鳳雞進行遺傳多樣性評估，發現使用家系等量隨機選配保種法進行保種，可保持龍勝鳳雞豐富的遺傳多樣性。

家禽品種資源的保種工作，是一項長期且艱巨的工作。家禽保種工作中，易受外界環境因素影響，且在繁育中，人為進行方向性的選擇。雖然這樣有利于生產需求，也有利于外觀性狀的選擇，但卻有可能導致一些潛在優勢基因的丟失。根據Liu[7]等人和Miao[8]等人對家雞母系世系的劃分，發現在龍勝鳳雞中存在小部分的商品雞血統，提示它們很可能曾經存在與商品雞雜交，需進一步提純，這一結果與Liao[9]等人的研究結果相似。品種改良的初衷是提高種禽的生產效率并保持原來的優良性狀，但需注意應保持原種的純正，避免混入其他血統。

4 結論

龍勝鳳雞的微衛星多態信息含量及線粒體mtDNAD-loop區存在豐富的遺傳多樣性及較低的變異程度，對雞群的保種和開發利用具有重要意義，從分子水平上為龍勝鳳雞的遺傳資源保護和開發利用提供了參考。

參考文獻

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[2]黃耀江，許宙，周文化，等.雞的遺傳多樣性的研究方法及研究進展[J].現代生物醫學進展，2007，7（5）：762-764.

[3]黎小青，李春風，初曉輝，等.中國地方雞種DNA分子水平遺傳多樣性的研究進展[J].中國畜牧獸醫，2012，39（3）：145-148.

[4]白文林，尹榮煥，楊桂芹，等.應用微衛星DNA標記進行邊雞群體遺傳多樣性分析[J].江西農業大學學報，2007，29（3）：423-428.

[5]莫國東，廖玉英，黃英飛，等.優質禽育種與安全生產技術[M].長春：吉林科學技術出版社，2014：38-43.

[6]賈曉旭，唐修君，陸俊賢，等.基于線粒體DNAD-loop區全序列分析大圍山微型雞遺傳多樣性及其起源進化關系的研究[J].南京農業大學學報，2015，38（4）：656-660.

[7]Liu Y P，Wu G S，Yao Y G，et al.Multiple maternalorigins of chickens：Out of the Asian jungles[J].MolecularPhylogenetics and Evolution，2006，38（1）：12-19.

[8]Miao Y W，Peng M S，WuGS，et al.Chicken domestication：an updated perspective based on mitochondrial genomes[J].Heredit，，2013，110（3）：277-282.

[9]Liao Y，Mo G，Sun J，et al.Genetic diversity of Guangxichicken breeds assessed with microsatellites and the mitochondrialDNA D-loop region[J].Molecular Biology Reports，2016，43（5）：415-425.

基金項目：廣西創新驅動發展專項“廣西畜禽種質資源的收集、評價與鑒定”（合同號：桂科AA 17204024）

作者簡介：黃英飛（1990-），女，壯族，助理畜牧師，研究方向：畜禽育種。

通信作者：廖玉英，Email：315951610@qq.com