基于UHPLC-UV-Q-TOF-MS/MS的厚樸不同方法姜制前后化學成分定性研究

孫戡平 秦昆明 李偉東 彭思穎 金俊杰 楊冰 蔡寶昌

摘要? 采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術定性分析方法，探討厚樸姜制前后以及不同姜制方法化學成分變化。定性采用正負離子掃描模式，利用Peakview1.2軟件分析鑒定出35種成分，發現厚樸姜制前后質變成分較少，并結合MarkerView1.2.1軟件進行主成分分析和 t 檢驗，得出6種主要差異性成分發現厚樸經過姜炙之后厚樸酚、厚樸三酚、十四烷酸、十六烷酸含量增加，藍桉醇含量減少，上述化學成分的差異可能是厚樸生品和制品臨床功效不同的主要原因。

關鍵詞? 厚樸;姜制;UHPLC-Q-TOF-MS/MS;HPLC-UV;定性分析;化學成分

Qualitative Study on Chemical Composition of Ginger Magnolia with Different Methods Based on UHPLC-UV-Q-TOF-MS/MS

Sun Kanping1，2，Qin Kunming3，Li Weidong4，Peng Siying1，3，Jin Junjie2，4，Yang Bing1，2，Cai Baochang1，2，3

（1 Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China; 2 Nanjing Haichang Chinese Medicine Corporation，Nanjing 210061，China; 3 Nanjing Haiyuan Prepared Slices of Chinese Crude Drugs Co.Ltd，Nanjing 210061，China; 4 Nanjing Haisheng Pharmaceutical Co.Ltd，Nanjing 210061，China）

Abstract? A qualitative analytical method based on quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry （UHPLC-Q-TOF-MS/MS） was developed for identification of multi-constituents of raw Magnolia （RM） and processed Magnolia （GM）.UHPLCQ-TOF-MS/MS qualitative analysis was performed under positive and negative ion modes and a total of 35 chemical compounds were identified.The analysis data were subjected to a principle component analysis with a t-test.Five peaks were found to be the main difference （ P <0.05） between RM and GM.The results indicated that there was higher magnatriol，magnolol，tetradecanoic acid，palmitic acid，chlorogenic acid in GM than in RM.However，there were fewer levels of globulol in the GM than RM，which may be the main reason for different clinical efficacy of RM and GM.

Key Words? Magnolia officinalis; Ginger progressed; UHPLC-Q-TOF-MS/MS; Qualitative analysis; Chemical components

中圖分類號：R286 文獻標識碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2019.02.007

厚樸為木蘭科植物厚樸 （Magnolia officinalis Re-hd.et Wils.）或凹葉厚樸（Magnolia officinalis Rehd.etWils.var.biloba Rehd.et Wils.） 的干燥干皮、根皮及枝皮，具有燥濕化痰、下氣除滿的功效[1]。生厚樸對咽喉具有一定的刺激性，姜炙后不僅消除刺激性還增強寬中和胃的效果，故臨床多用姜厚樸入藥[2]。現今姜制厚樸多以干姜汁或生姜汁炙，炮制前后臨床療效發生變化，這些變化物質基礎是厚樸炮制前后化學成分發生變化，該變化在如今的研究中尚不明確[3]。因此，有必要對厚樸炒制前后化學成分進行進一步研究，揭示厚樸中的主要成分以及這些成分炮制前后的變化。

超高效液相色譜與質譜聯用技術（UHPLC-Q-TOF-MS/MS）[4]集高效分離能力的色譜，高分辨、高靈敏、強定性能力的質譜于一體，已成為中藥成分研究的最有效的分析工具之一。厚樸中主要成分為厚樸酚類（厚樸酚）和揮發油類（桉油醇）物質[5]。本研究以厚樸生品和不同姜制品為研究對象，采用UHPLC-QTOF-MS/MS技術定性的分析方法，探討厚樸炒不同姜制法炮制后化學成分變化，試圖從化學成分角度闡述炒制對厚樸藥效物質基礎的影響，為臨床用藥提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

日本Shimadzu超高效液相色譜儀（配有LC-30AD二元液相泵、SIL-30SD自動進樣器、DGU-20A5R在線脫氣機、CTO-30A柱溫箱）;美國AB SCIEXTripleTOF 5600+系統（配有電噴霧離子源ESI）;數據采集軟件：Analyst TF1.6 software（ABSCEIX，USA）;數據處理軟件系統：Peakview 1.2 software（ABSCEIX，USA）和Markerview 1.2.1 software（ABSCEIX，USA）;30A超高效液相色譜分析系統（日本島津公司）;SPE固相萃取小柱;Shimadzu LC-20AB高效液相色譜系統（ 日本島津公司，包括在線脫氣機、ProminenceSIL-20A自動進樣器、SPD-M20A二極管陣列檢測器、CTO-20A柱溫箱）;KQ5200DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;BP121S電子分析天平（梅特勒-托雷多公司）。

1.2 試劑

厚樸購自南京海源中藥飲片有限公司（批號：170601;產地：湖北），干姜購自南京海源中藥飲片有限公司（批號：170802;產地：山東），經南京海源中藥飲片有限公司丁斐執業藥師鑒定。色譜純甲酸、質譜純甲醇、質譜純乙腈（德國E.Merck）;水為Milliporeill-Q超純水。

1.3 分析樣品

生姜炙厚樸：取厚樸絲，加生姜汁拌勻，悶潤至姜汁被吸盡，用文火80～120 ℃炒干既可;生姜洗凈，搗爛，加適量水，榨取姜汁，姜汁和生姜比為1∶ 1，厚樸每100 kg用生姜10 kg。干姜炙厚樸：取干姜煎煮3次，合并濾液濃縮，取厚樸絲，加干姜汁拌勻，悶潤至姜汁被吸盡，用文火80～120 ℃炒干既可，厚樸每100 kg用干姜0.3 kg[6-7]。

2 方法與結果

2.1 質譜條件

UHPLC-Q-TOF-MS/MS色譜條件采用YMC C18反向色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），前置Aglient C18預柱;流動相A（0.1%甲酸水溶液）-B（乙腈），梯度洗脫，程序為0～3 min，15% ～13%B;6～13 min，21% ～30%B;18～23 min，45% ～55%B;24～32 min，100% ～100%B;32～34 min，5% ～5%B;流速0.3 mL/min;柱溫35 ℃，進樣體積3 μL。質譜條件UHPLC-Q-TOF-MS/MS系統使用ESI離子源，分別在正、負離子模式下采集數據。ISVF為4 500/-4 500 V，TEM為550 ℃，DP為60/-60 V，CE為35/-35 eV，霧化氣體為氮氣，Gas1為55 psi（1 psi≈6.9 kPa），Gas2為55 psi，Curtain Gas為35 psi。一級質譜母離子掃描范圍為 m/z 100～2 000，二級質譜子離子掃描范圍為 m/z 50～1 000，開啟動態背景扣除（DBS）。

2.2 供試品溶液的制備

取厚樸及姜制厚樸粉（60目）各1.5 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，精密加入甲醇溶液30 mL，超聲提取30 min，取出稱定重量，用甲醇補足減失重量，靜置后濾過，取續濾液過SP小柱進行稀釋即可。

2.3 數據庫的建立

借助于CNKI、PubMed和SciFinder等數據庫檢索厚樸相關文獻，盡可能全面地建立包含中藥厚樸中所含化合物的分子式、分子質量和化學名稱等信息數據庫，并借助于ChemicalBook、ChemSpider等下載各個化合物的mol文件，計算其在正離子模式下常見離子[M+H]+、[M+NH4]+和負離子模式下常見離子[M-H]-、[M+COOH]-等多種離子形態的精確質荷比數值[8]。

2.4 軟件應用

將所得各組原始質譜數據導入PeakView軟件中，通過分析比較各個化合物由總離子流圖提取到的二級碎片與其mol文件所對應的碎片之間的匹配以及相關文獻數據對比進行化學成分確認，最終誤差<5 ppm的成分被鑒定出來;并借助于Markerview軟件對多批厚樸生品和姜制品原始質譜數據進行主成分分析和組間 t 檢驗分析，得出其PM得分圖和載荷圖。

2.5 成分鑒別和分析

厚樸生品和炮制品在正、負離子模式下的總離子流圖（圖1），正負離子2種模式下共鑒別出35種化合物。見表1。以厚樸酚為例來說明鑒別過程，峰19的[M-H]+為267.530，對應分子式為C18H18O2，質量數為266.334 1，主要二級碎片為 m/z 115.0542，發現質量數正好與厚樸酚和和厚樸酚相當，推測該化合物為厚樸酚或和厚樸酚，將厚樸酚的mol文件所預測的碎片與二級碎片進行匹配，比較厚樸酚與和厚樸酚的極性，厚樸酚的極性小于和厚樸酚應后出峰，最終確認該化合物為厚樸酚。其他化合物采用類似鑒定方法，鑒定出來的35種成分主要是生物堿類和酚類成分，可以看出厚樸姜制前后質變成分較少。

運用Markerview軟件進行PCA分析和 t 檢驗，在正、負離子模式下厚樸樣品的得分圖、載荷圖。見圖2、3。根據主成分分析得分圖可以看出，6批厚樸生品和生姜炮制品、干姜炮制品分別聚成3類，表明厚樸生品和干姜炮制品、生姜炮制品在第一主成分得分上有明顯的差異，即分別聚向橫軸的相反方向，說明厚樸不同組別三者的UHPLC-Q-TOF-MS/MS數據存在明顯的差異;載荷圖中對類別差異產生影響的離子的貢獻大在載荷圖中以其原點距離表示，圖中每個點代表對分類貢獻的成分，即對其分類影響越大的離子在載荷圖中距離原點的距離越遠。在差異性成分分析中， P <0.05的成分被鑒定出來，其中t-value>0表示成分峰強度減小;t-value<0，表明成分峰強度增大。在鑒定出的35種成分中共得出6種差異性成分，發現厚樸姜炙后，厚樸酚、厚樸三酚、十四烷酸、十六烷酸含量增加，藍桉醇含量減少。

3 討論

厚樸姜炙后，厚樸酚、厚樸三酚、十四烷酸、十六烷酸含量增加，藍桉醇含量減少，推測姜炙有利于厚樸中厚樸酚的溶出，使其含量增加，這同臨床用藥一致，厚樸姜炙后可增強化濕作用[9]。姜汁中姜醇、姜烯、水芹烯、檸檬醛、芳樟醇的主要成分構成了一定堿性環境，厚樸酚在堿性條件下經過加熱乙烯基雙鍵斷裂通過酸堿反應形成羧基，羥基替換基團，從而形成厚樸三酚[10]，這與UHPLC-Q-TOF-MS/MS定性分析中厚樸酚的部分裂解規律吻合，這可能是厚樸三酚含量增加的原因。厚樸酚和和厚樸酚是互為同分異構體的新木脂素，二者生物合成途徑相似，常常共存于植物體內[11]，兩者均有特殊的、持久的肌肉松弛作用及強的抗菌作用[12]，推測厚樸在姜炙過程中，2種同分異構體之間可能相互轉化，但這些變化是如何產生的，這些成分在炮制過程中的變化及規律都有待進一步研究。生姜、干姜的主要成分為揮發油[13-14]，而揮發油受熱易揮發，故推測姜制厚樸中十四烷酸的增加是由于生姜汁或干姜汁內含大量十四烷酸和十六烷酸。

本文利用HPLC-UV液相色譜與UHPLC-Q-TOFMS/MS質譜聯用技術，明確了厚樸姜炙前后的6種主要差異成分及其變化趨勢，對6個不同產地姜炙前后的厚樸分別進行驗證，各成分的變化趨勢同定性結果一致，進一步驗證了6種差異性成分選取的代表性和可靠性。本研究從炒制前后成分的變化入手，探究了炮制對厚樸物質基礎的影響，為厚樸的質量控制研究提供了新的思路，為其藥效物質基礎研究提供了科學依據。

厚樸酚具有抗菌、肌肉松弛作用和抗凝作用，抗腫瘤范圍廣可醫治包括前列腺癌細胞、卵巢癌細胞、組織細胞淋巴瘤、膀胱癌細胞等多種惡性癌細胞[15]，作為活性成分的厚樸酚含量姜炙后增加，提示可能是姜制厚樸增效的原因之一。厚樸三酚與厚樸酚具有相似的結構，筆者推測其有相似的藥理功效，姜制厚樸的藥效增加與其含量增加有關。至于藍桉醇、十四烷酸、十六烷酸含量變化與厚樸炮制后藥效變化有何影響尚不明確，有待更加深入的研究。

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