基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS的白芍炒制前后化學成分研究

任娟 劉曉 李偉東 蔡皓 朱曉釵 蔡寶昌

摘要? 目的：采用超高效液相色譜串聯四極桿飛行時間質譜法，探討白芍炒制前后化學成分的變化。方法：采用Agilent C18色譜柱，0.1%甲酸水溶液-乙腈梯度洗脫，體積流量0.3 mL/min，串聯四級桿飛行時間質譜分別測定不同產地各10批生、炒白芍中的化學成分。結果：分別在生、炒白芍中鑒定出40種化學成分。結論：通過UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術，為分析生、炒白芍中的化學成分提供一種快速、高效的分析方法，為綜合評價生白芍和炒白芍的質量提供參考。

關鍵詞? 白芍;炒制;UHPLC-Q-TOF-MS/MS;四極桿;化學成分

Qualitative Analysis of Major Constituents of Raw and Processed Paeonia Lactiflora by UHPLC-Q-TOF-MS/MS

Ren Juan1，2，Liu Xiao2，Li Weidong2，Cai Hao2，Zhu Xiaochai2，Cai Baochang2，3，4

（1 Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210009，China; 2 Engineering Center of State Ministry of Education for Standardization of Chinese Medicine Processing，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China; 3 Nanjing Haiyuan Prepared Slices of Chinese Crude Drugs Co.Ltd，Nanjing 210061，China; 4 Nanjing Haichang Chinese Medicine Corporation，Nanjing 210061，China）

Abstract Objective： By using ultra-high performance liquid chromatography tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometry，to investigate the changes of chemical composition in Paeonia lactiflora before and after progressed. Methods： Agilent C18 column，0.1% formic acid aqueous solution-acetonitrile gradient elution，volume flow rate 0.3 mL/min，tandem four-stage rod time-of-flight mass spectrometry were used to determine the chemical composition of 10 batches of raw and fried white peony in different producing areas. Results： A total of 40 chemical components were identified in raw Paeonia lactiflora （RPL） and processed Paeonia lactiflora （PPL）. Conclusion： UHPLC-Q-TOF-MS/MS technology provides a fast and efficient analytical method for the analysis of chemical constituents in RPL and PPL，which provides a reference for comprehensive evaluation of the quality of RPL and PPL.

Key Words? Paeonia lactiflora; Processing; UHPLC-Q-TOF-MS/MS; Quadrupole; Chemical components

中圖分類號：R932 文獻標識碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2019.02.003

白芍（ Cynanchum otophyllum） 為毛茛科植物芍藥（ Paeonia lactiflora? Pall.）的干燥根，氣微，味微苦、酸，性微寒，歸肝、脾經，具有養血調經、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽的功效，用于血虛萎黃、月經不調、自汗、盜汗、脅痛、腹痛、四肢攣痛、頭痛眩暈[1]。現代藥理學研究表明，白芍具有抗炎、鎮痛、增強免疫、保肝等作用[2-4]。2015年版《中華人民共和國藥典》收載其飲片品種有白芍、炒白芍、酒白芍。白芍經清炒后，以養血和營、斂陰止汗為主;經酒炒后，降低酸寒伐肝之性，入血分，善于調經止血，柔肝止痛[5]。現代研究表明，白芍中的化學成分主要有單萜苷類、酚酸類、沒食子酰葡萄糖類、揮發油類等[6]，其中芍藥苷、芍藥內酯苷、苯甲酰芍藥苷和氧化芍藥苷等單萜苷類化合物被認為是白芍的重要藥效物質基礎[7-9]。2015年版《中華人民共和國藥典》通過測定芍藥苷含量對白芍進行質量控制，但是中藥具有多成分、多靶點的特點，測定單一成分難以反映飲片的整體質量，高效分離能力的色譜與高分辨、高靈敏的質譜串聯技術已在多組分中藥及復方成分定性分析中逐漸凸顯出獨特優勢[10-12]。近年來針對白芍化學成分的研究已有文獻報道[13-15]，但同時針對白芍和炒白芍中化學成分的研究尚少，故本研究采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS分析白芍和炒白芍中的化學成分，為其質量控制提供較全面的依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 KQ5200DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;BP121S電子分析天平（梅特勒-托雷多公司）。日本Shimadzu超高效液相色譜儀（配有LC-30AD二元液相泵、SIL-30SD自動進樣器、DGU-20A5R在線脫氣機、CTO-30A柱溫箱）;美國AB SCIEX Triple TOF 5600+系統（配有電噴霧離子源ESI）;數據采集軟件：Analyst TF1.6 software（ABSCEIX，USA）;數據處理軟件系統：Peakview 1.2 software（AB SCEIX，USA）;30A超高效液相色譜分析系統（日本，島津公司）;SPE固相萃取小柱。

1.2 試劑? 質譜純甲酸、質譜純甲醇、質譜純乙腈（德國E.Merck）;水為Milliporeill-Q超純水，每日自制。

1.3 分析樣品 實驗中所用10批生白芍和10批炒白芍樣品均購自醫院和藥店，經江蘇省中醫院副主任中藥師袁家財鑒定，為毛茛科植物芍藥（ Paeonia lactiflora Pall. ）的干燥根。

2 方法與結果

2.1 UHPLC-Q-TOF-MS/MS色譜質譜條件 色譜條件：采用Agilent C18反向色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流動相A（0.1%甲酸水）-B（乙腈），梯度洗脫，程序為0～2 min，5% ～13% B;2～12 min，13% ～19% B;12～15 min，19% ～33% B;15～18 min，33% ～55% B;18～22 min，55% ～100% B;流速0.3 mL/min;柱溫35 ℃，進樣體積2 μL。質譜條件：Q-TOF-MS/MS系統使用ESI離子源，分別在正、負離子模式下采集數據。ISVF為4 500/-4 500 V，TEM為550 ℃，DP為60/-60 V，CE為35/-35 eV，霧化氣體為氮氣，Gas1為55 psi（1 psi≈6.9 kPa），Gas2為55 psi，Curtain Gas為35 psi。 一級質譜母離子掃描范圍為 m/z? 100～2 000，二級質譜子離子掃描范圍為 m/z? 50～1 000，開啟動態背景扣除（DBS）。

2.2 供試品溶液的制備 取白芍及炒白芍粉（60目）各0.5 g，精密稱定，分別置50 mL容量瓶中，加入50%甲醇溶液35 mL，超聲提取30 min，取出，用50%甲醇溶液定容。取1.5 mL溶液置2 mL離心管，13 000 r/min離心5 min，精密移取1 mL上清液過SPE柱，梯度洗脫：10%甲醇1 mL，30%甲醇2 mL，50%甲醇3 mL，70%甲醇2 mL，100%甲醇1 mL，合并洗脫液，取1.5 mL洗脫液置2 mL離心管，13 000 r/min離心5 min，取上清液即得。

2.3 數據庫的建立 借助于CNKI、PubMed和SciFinder等數據庫檢索白芍相關文獻，盡可能全面地建立包含中藥白芍中所含化合物的分子式、分子質量和化學名稱等信息數據庫，并借助于ChemSpider、ChemicalBook等網絡數據庫下載各個化合物的mol文件，計算其在正離子模式下常見離子[M+H]+、[M+NH4]+和負離子模式下常見離子[M+COOH]-、[M-H]-等多種離子形態的精確質荷比數值[16-18]。

2.4 軟件應用? 將白芍生品和炒品的原始質譜數據導入PeakView軟件中，通過分析比較各個化合物由總離子流圖提取到的一級質量數與理論質量數比對以及二級碎片與其mol文件所對應的碎片之間的匹配進行化學成分確認，最終質量數誤差5 ppm以內、結構匹配度達到80%以上的成分被鑒定出來。

2.5 成分鑒別和分析 白芍生品和炒品在正、負離子模式下的總離子流圖。見圖1。正、負離子2種模式下共鑒別出40種化合物。見表1。以芍藥苷為例來說明鑒別過程，峰17的[M-H]-為479.155 89，對應分子式為C23H28O11，質量數為480.163 16，主要二級碎片為 m/z? 121.030 8，327.108 1，479.179 7，77.042 9，與文獻報道芍藥苷的二級質譜碎片離子相一致，推測該化合物為芍藥苷，將芍藥苷的mol文件所預測的碎片與二級碎片進行匹配，最終確認該化合物為芍藥苷。其他化合物采用類似鑒定方法，分別于生、炒白芍中鑒定出來40種成分，其化學種類主要是單萜苷類和酚酸類成分，從成分種類來看，白芍炒制前后沒有質變成分。

3 討論

供試品溶液制備時，考察了不同濃度甲醇作為提取溶劑，結果顯示50%的濃度下，白芍TIC圖譜上的峰較多，提取比較完全，又考察了分別用甲醇和乙醇作為提取液，發現甲醇提取峰形更好，所以選擇用50%甲醇做提取溶劑。

白芍清炒后，藥性緩和，藥效偏于柔肝、和脾、止瀉。本實驗對炮制前后的化學成分進行研究，鑒定出的40種成分在生品和炮制品中種類未見顯著性差異，白芍炒后藥性緩和，可能是因為炒制后有效成分的含量發生了變化，有待進一步的研究。

本實驗采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術，通過數據庫匹配及二級結構分析，參考相關文獻，鑒定了白芍和炒白芍中40種化學成分。該方法快速、簡便、靈敏度高，可為白芍及其炮制品后續的化學成分研究、藥理研究以及質量控制提供參考。

參考文獻

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].一部.北京：中國醫藥科技出版社，2015：105.

[2]賀妮，侯宇，柏慧，等.白芍提取物抗抑郁及抗炎作用的研究[J].世界中西醫結合雜志，2018，13（3）：348-352.

[3]段文娟，李月，楊國紅，等.白芍對斑馬魚促血管生成和抗血栓作用的研究[J].時珍國醫國藥，2018，29（4）：834-837.

[4]左志燕，詹淑玉，黃嬛，等.白芍總苷保肝作用的藥動學和藥效學研究進展[J].中國中藥雜志，2017，41（20）：22-27.

[5]蔡寶昌.中藥炮制學[M].北京：中國中醫藥出版社，2012：167.

[6]譚淑瑜，肖雪，樸勝華，等.白芍水溶性成分快速鑒定研究[J].中藥材，2017，40（1）：94-100.

[7]Cao W J，Zhang W，Liu J J.Paeoniflorin improves survival in LPS-challenged mice through the suppression of TNF-alpha and IL-1 beta release and augmentation of IL-10 production[J].International Immunopharmacology，2010，11（2）：172-178.

[8]Wang Q S，Gao T，Cui Y L，et al.Comparative studies of paeoniflorin and albiflorin fromPaeonia lactiflora on anti-inflammatory activities[J].Pharmaceutical Biology，2014，52（9）：1189-1195.

[9]Yen，Pham Hai，et al.A new monoterpene glycoside from the roots ofPaeonia lacti-flora increases the differentiation of osteoblastic MC3T3-E1 cell[J].Archives of Pharmacal Research，2007，30（10）：1179-1185.

[10] 陶益.地黃炮制前后化學成分的UHPLC-Q-TOF/MS比較研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2016，27（1）：102-106.

[11]陳堅平，鐘艷梅，余楚欽，等.UHPLC-Q-TOF-MS法分析蒿甲虛熱清顆粒的化學成分[J].中藥材，2017，40（6）：1368-1372.

[12]王志成，季雪，崔韶婧，等.基于超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜技術的通脈顆粒質量評價研究[J].藥物評價研究，2016，39（4）：603-607.

[13]童黃錦，白發平，汪小莉，等.不同產地白芍藥材的指紋圖譜研究[J].中醫學報，2014，29（9）：1326-1329.

[14]翁金月，曹崗，吳鑫，等.基于多指標成分的白芍麩炒前后特征指紋圖譜比較研究[J].中華中醫藥學刊，2015，33（5）：1056-1057.

[15]梁德勤，趙園園，羅云，等.不同加工方式亳白芍的高效液相指紋圖譜及多成分含量比較[J].安徽中醫藥大學學報，2018，37（2）：85-89.

[16]周海玲，許舜軍，周若龍，等.白芍、赤芍化學成分的高效液相色譜-飛行時間串聯質譜分析[J].中藥材，2018，41（7）：1638-1641.

[17]練杭蕓，徐王彥君，梁乾德，等.UPLC-QTOF MS法比較赤芍、白芍煎液化學成分差異[J].質譜學報，2014，35（3）：269-278.

[18]Minxia Z，Zhe C，Pei L，et al.Analysis and identification of glycosides in Paeonia lactiflora by UPLC-MS/MS[J].China Journal of Chinese Materia Medica，2011，36（12）：1641-1643.