IGF`-1過表達質粒轉染BMSCs聯合納米纖維多孔支架修復兔軟骨缺損效果

張防　朱一鵬　聶文波　葉發剛

[摘要]目的探討慢病毒介導胰島素樣生長因子1（IGF`-1）過表達質粒轉染骨髓間充質干細胞（BMSCs）聯合Gelatin/PLA納米纖維多孔支架修復兔軟骨缺損的效果。方法構建慢病毒IGF`-1過表達載體，分離、培養并鑒定BMSCs，構建納米纖維多孔支架+轉染IGF`-1過表達載體BMSCs復合物。構建兔膝關節軟骨缺損模型，采用蘇木精`-伊紅染色和免疫組織化學方法觀察納米纖維多孔支架+轉染IGF`-1過表達載體BMSCs復合物對兔軟骨缺損的修復效果。結果納米纖維多孔支架+轉染IGF`-1過表達載體BMSCs復合物支架表面黏附的細胞數較納米纖維多孔支架+未轉染BMSCs復合物明顯增多。大體觀察顯示，實驗組（造模后植入納米纖維多孔支架+轉染IGF`-1過表達載體BMSCs復合物）兔軟骨缺損的修復效果要明顯優于對照組（造模后植入納米纖維多孔支架+未轉染BMSCs復合物）。蘇木精`-伊紅染色顯示，對照組兔軟骨缺損多為纖維性修復，而實驗組多為細胞性修復。免疫組織化學染色顯示，實驗組修復軟骨組織中Aggrecan和Ⅱ型膠原的含量要明顯高于對照組（F=15.342、18.928，P<0.05）。結論納米纖維多孔支架+轉染IGF`-1過表達載體BMSCs復合物可以促進BMSCs向軟骨細胞的分化，并且分泌更多的含Aggrecan和Ⅱ型膠原成分的細胞外基質，從而發揮促進軟骨缺損修復的作用。

[關鍵詞]組織支架;納米復合物;間質干細胞移植;胰島素樣生長因子Ⅰ;軟骨缺損;兔;治療結果

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of bone marrow mesenchymal stem cell （BMSC） transfection with lentivirus`-mediated insulin`-like growth factor`-1 （IGF`-1） overexpression plasmids combined with Gelatin/PLA nanofiber porous scaffold in the treatment of rabbits with cartilage defect. MethodsThe lentivirus IGF`-1 overexpression vector was constructed， BMSCs were isolated， cultured， and identified， and the complex of nanofiber porous scaffold+BMSCs transfected with IGF`-1 overexpression vector was constructed. A rabbit model of knee cartilage defect was established， and hematoxylin and eosin （HE） staining and immunohistochemical staining were used to evaluate the effect of the complex of nanofiber porous scaffold+BMSCs transfected with IGF`-1 overexpression vector in the repair of cartilage defect in rabbits. ResultsThe complex of nanofiber porous scaffold+BMSCs transfected with IGF`-1 overexpression vector had a significantly higher number of cells attached on the scaffold surface than the complex of nanofiber porous scaffold+BMSCs not transfected with IGF`-1 overexpression vector. Gross observation showed that the experimental group （with the transplantation of the complex of nanofiber porous scaffold+BMSCs transfected with IGF`-1 overexpression vector after modeling） had significantly better repair of cartilage defect than the control group （with the transplantation of the complex of nanofiber porous scaffold+BMSCs not transfected with IGF`-1 overexpression vector after modeling）. HE staining showed mainly fibrous repair in the control group and cellular repair in the experimental group. Immunohistochemical staining showed that the experimental group had significantly higher content of Aggrecan and type Ⅱ collagen in the repaired cartilage than the control group （F=15.342 and 18.928，P<0.05）. ConclusionThe complex of nanofiber porous scaffold+BMSCs transfec`-ted with IGF`-1 overexpression vector can promote the differentiation of BMSCs into chondrocytes， increase the secretion of extracellular matrix containing more Aggrecan and type Ⅱ collagen， and thus promote the repair of cartilage defect.

[KEY WORDS]tissue scaffolds; nanocomposites; mesenchymal stem cell transplantation; insulin`-like growth factorⅠ; cartilage defect; rabbits; treatment outcome

骨髓間充質干細胞（BMSCs）具有多向分化潛能[1`-3]，可以分化成骨細胞、軟骨細胞以及神經細胞等[4`-7]。新近研究表明，BMSCs可以在特定誘導條件下轉化成軟骨細胞，進而促進骨與軟骨損傷的修復，而且BMSCs來源于病人自體，移植后可以避免排斥反應，這為臨床上軟骨缺損的修復提供了一個新的思路[8`-10]。胰島素樣生長因子`-1（IGF`-1）是一類光譜性促生長因子，其結構與胰島素原類似，可以促進細胞和組織生長[11`-13]。既往研究表明，IGF`-1與骨密度有關，其表達量增多時，骨密度也相應增加，IGF`-1對臨床老年性骨質疏松具有明顯的治療效果[14`-15]。也有研究結果表明，組織工程材料纖維多孔支架可以促進軟骨缺損的修復[16`-17]。然而尚未有相關研究以BMSCs為種子細胞，用IGF`-1基因過表達質粒轉染BMSCs，并結合Gelatin/PLA納米纖維多孔支架構建組織工程支架。本研究通過制備Gelatin/PLA納米纖維多孔支架，體外培養兔來源的BMSCs，構建細胞和支架的聯合培養體系，觀察IGF`-1過表達質粒轉染BMSCs聯合納米纖維多孔支架對兔軟骨缺損的修復效果，以期為臨床上軟骨缺損的治療提供思路與方法。

1材料與方法

1.1實驗材料

新西蘭大白兔購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司;DMEM、TRIZOL及2.5 g/L胰蛋白酶Trypsin購自美國Invitrogen公司;胎牛血清購自美國Gibco公司;逆轉錄試劑盒購自美國ABI Applied Biosystems公司;Real`-time PCR儀購自美國Bio`-rad公司。

1.2實驗方法

1.2.1兔來源BMSCs的分離和培養新西蘭大白兔以利多卡因20 mL局部麻醉，利用骨穿穿刺針提取新鮮骨髓，按1∶3體積比加入含體積分數0.01胎牛血清、105 U/L青霉素的DMEM細胞培養液，充分混勻后，移入25 cm2的Hank培養瓶中，以差速培養法培養，3 d后去掉培養瓶中的油脂等雜質，之后每3 d換1次細胞培養液。BMSCs細胞融合率達70%～80%后進行傳代培養。

1.2.2BMSCs的鑒定采用倒置光學顯微鏡觀察BMSCs的細胞形態;采用流式細胞儀檢測BMSCs CD29、CD44、CD71、CD90和CD106等表面蛋白的表達。

1.2.3慢病毒IGF`-1過表達載體的構建慢病毒IGF`-1過表達載體是由上海吉凱基因公司合成，以pHBLV`-U6`-ZsGreen`-PGK`-Puro作為質粒的克隆載體。慢病毒IGF`-1過表達載體克隆切入點是XhoI/BamHI，并經基因測序證明序列的正確性。

1.2.4慢病毒細胞轉染取第2代BMSCs，將其接種到6孔板，待細胞融合率達50%時根據轉染說明書進行慢病毒轉染，MOI=50，慢病毒滴度為3×107 mg/L。

1.2.5Gelatin/PLA三維支架的制備和檢測將10 g明膠粉末溶解于8 mL六氟異丙醇中，用玻璃棒攪拌至充分溶解。加入3 mL的PLA溶液，制備PLA質量分數為0.20的Gelatin/PLA支架材料，采用無紡布作為接收裝置，利用靜電紡技術制備Gelatin/PLA納米纖維膜。將3 g納米纖維膜打碎，加入100 mL叔丁醇溶液中，用冷凍干燥機完全冷凍后得到Gelatin/PLA三維支架。應用掃描電鏡對絲蛋白支架結構以及細胞共培養體系（包括納米纖維多孔支架+轉染IGF`-1過表達載體BMSCs復合物、納米纖維多孔支架+未轉染BMSCs復合物）進行觀察。

1.2.6動物分組及膝關節軟骨缺損模型構建取15只成年健康新西蘭大白兔，隨機分為3組，每組5只。以150 g/L水合氯醛3 mL/kg靜脈內麻醉兔，常規皮膚消毒、鋪無菌單，取膝關節正中側切口，長約2 cm，逐層切開皮膚、皮下軟組織、淺深筋膜，顯露膝關節，使用口腔鉆在兔股骨側軟骨鉆孔制成軟骨缺損（長5 mm、寬2 mm、深3 mm的錐形軟骨缺損），生理鹽水沖洗后，實驗組和對照組分別用納米纖維多孔支架+轉染IGF`-1過表達載體BMSCs復合物和納米纖維多孔支架+未轉染BMSCs復合物填滿缺損部位（約100 mg），模型組以生理鹽水代替，逐層縫合。

1.2.7軟骨缺損部位組織蘇木精`-伊紅染色術后14 d切取各組兔軟骨缺損部位組織，以40 g/L多聚甲醛固定，行脫鈣、系列二甲苯、梯度乙醇處理，自來水沖洗，蘇木精`-伊紅染色，封片，在倒置光學顯微鏡下觀察。

1.2.8軟骨缺損部位組織Aggrecan和Ⅱ型膠原表達檢測采用免疫組化SP法。軟骨缺損部位組織切片、脫蠟，以PBS沖洗3次，每次5 min;切片室溫放置30 min，以PBS沖洗3次，每次5 min;用BSA室溫處理10 min，加Aggrecan和Ⅱ型膠原一抗（Novus Biologicals，Littleton，美國）4 ℃過夜，以PBS沖洗3次，每次5 min;加辣根酶標記鏈酶卵白素液孵育10 min，以PBS沖洗3次，每次5 min;加

2期張防，等. IGF`-1過表達質粒轉染BMSCs聯合納米纖維多孔支架修復兔軟骨缺損效果157

入AlexaFouor 488羊抗兔IgG二抗（Novus Biolo`-gicals，Littleton，美國）室溫孵育20 min，以PBS洗3次，每次5 min;DAB顯色4 min，再以蘇木精復染2 min，倒置光學顯微鏡下觀察。應用Image J軟件分析染色強度。

1.3統計學方法

應用SPSS 16.0軟件進行統計學分析，所得計量資料數據以±s形式表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1BMSCs的培養和鑒定

接種48 h后，原代BMSCs開始貼壁，細胞呈梭形或者多角形;培養至第2代后，細胞增殖迅速，呈旋渦狀或者輻射狀生長。流式細胞儀檢測第2代細胞的表面蛋白CD29、CD34、CD45和CD90的表達率分別為92.60%、4.24%、3.09%和89.30%。

2.2支架結構及聯合培養體系的掃描電鏡觀察

Gelatin/PLA三維支架納米膜表面結構空隙較大，有利于細胞黏附;支架表面粗糙，凹凸不平，有利于細胞的黏附和遷移。實驗組表面黏附的細胞數較對照組明顯增多。

2.3兔軟骨缺損部位組織的病理學觀察

術后14 d，大體觀察顯示，實驗組兔軟骨缺損部位有明顯的填充物，對照組兔軟骨缺損部位的填充物明顯少于實驗組，而模型組兔軟骨缺損幾乎沒有修復。軟骨缺損部位組織蘇木精`-伊紅染色顯示，對照組細胞結構少，支架略有降解，軟骨缺損多為纖維性修復;實驗組細胞深染，BMSCs向軟骨細胞轉化較多，軟骨缺損多為細胞性修復。

2.4兔軟骨缺損部位組織的免疫組化染色

模型組修復軟骨組織中細胞棕色染色較淺，對照組細胞棕色染色較深，實驗組細胞棕色染色更深。半定量分析結果顯示，對照組修復軟骨組織中Aggrecan和Ⅱ型膠原表達量明顯高于模型組，實驗組二者表達量明顯高于對照組，差異均有統計學意義（F=15.342、18.928，P<0.05）。見表1。

3討論

本實驗充分利用基因工程和組織工程技術的優勢，應用靜電紡法制備天然活性多孔Gelatin/PLA三維支架，體外培養兔來源的BMSCs，構建納米纖維多孔支架和BMSCs的聯合培養體系，觀察IGF`-1過表達質粒轉染BMSCs聯合納米纖維多孔支架對兔軟骨缺損的修復效果，以期為臨床上軟骨缺損的治療提供思路與方法。

IGF`-1是一種在分子結構上與胰島素類似的多肽蛋白物質，因其結構與胰島素類似而得名[18`-19]。鄔波等[20]的研究結果表明，IGF`-1可以促進BMSCs向軟骨細胞的分化。另有研究表明，IGF`-1除了可以促進BMSCs向軟骨細胞的分化之外，還可以促進脂肪干細胞向軟骨細胞的分化[21]。故本研究選擇IGF`-1過表達的BMSCs作為種子細胞。既往的研究結果表明，BMSCs復合異種骨基質明膠可以促進BMSCs向骨細胞轉化，有效修復大鼠橈骨缺損[22`-24]。但是這種方法需要符合特定條件的組織工程支架，也就是需要特殊的“土壤”，BMSCs這個“種子”才能更好地在其內生長并且分化，其臨床應用的安全性有待調查[25`-26]。有學者研究表明，利用慢病毒構建基因載體，轉染BMSCs后并不影響BMSCs的表型[27]。可見利用基因工程原理，構建基因過表達的BMSCs也是促進“種子”有效分化的一種手段。本研究正是立足于這一點，構建轉染慢病毒介導IGF`-1過表達質粒的BMSCs，制作新型“基因種子”，為軟骨缺損的臨床研究做準備。

有研究表明，抗生素/β`-磷酸三鈣多孔三維支架可以用于修復兔橈骨骨缺損[28]。本研究采用的多孔Gelatin/PLA三維支架具有良好的生物相容性和抗菌性，掃描電鏡觀察顯示，該支架表面凹凸不平，可以為BMSCs提供良好的黏附部位。這與新近的研究結果相似[29]，證明了研究設計方案的可行性。本研究還觀察到，BMSCs不僅可以很好地黏附在Gelatin/PLA三維支架表面，而且可以分泌細胞外基質，填充支架間孔，為臨床上軟骨缺損治療提供良好的自體來源的細胞基質。轉染IGF`-1過表達載體后，BMSCs分泌的細胞外基質更多。本研究體外實驗結果表明，轉染IGF`-1過表達載體后，BMSCs向軟骨細胞分化的效率明顯提高。體內實驗結果也表明，實驗組BMSCs向軟骨細胞轉化效率較高，軟骨缺損可以實現真正的“細胞修復”，而不是平常支架所達到的“纖維修復”。可見，Gelatin/PLA三維支架聯合IGF`-1過表達載體轉染BMSCs可以更好地發揮修復作用。另外，本研究還檢測了修復軟骨組織中Aggrecan和Ⅱ型膠原的表達，結果表明，Gelatin/PLA三維支架+轉染IGF`-1過表達載體BMSCs復合物可以促進Aggrecan和Ⅱ型膠原的表達，從而更多地合成細胞外基質，從細胞和細胞外基質兩個層面對軟骨進行修復。

綜上所述，Gelatin/PLA三維支架+轉染IGF`-1過表達載體BMSCs復合物可以促進BMSCs向軟骨細胞的分化，并且分泌更多的含Aggrecan和Ⅱ型膠原成分的細胞外基質，從而發揮促進軟骨缺損修復的作用。

[參考文獻]

[1]付勤，于東東，王勇，等. TGF`-β1和IGF`-1共同轉染大鼠BMSCs向軟骨細胞分化的實驗研究[J]. ?中國修復重建外科雜志， 2008，22（2）：157`-162.

[2]LAUDES M. Role of Wnt signalling in the determination of human mesenchymal stem cells into preadipocytes[J]. ?J Mol Endocrinol， 2011，46（2）：R65`-R72.

[3]ZHANG Weidong， ZHANG Fangbiao， SHI Hongcan， ?et al. ?Comparisons of rabbit bone marrow mesenchymal stem cell isolation and culture methods in vitro[J]. ?PLoS One， 2014，9（2）：e88794.

[4]SONG Peiwen， XIA Xiang， HAN Tianyu， ?et al. ?BMSCs promote the differentiation of NSCs into oligodendrocytes via mediating Id2 and Olig expression through BMP/Smad signaling pathway[J]. ?Biosci Rep， 2018. doi：10.1042/BSR20180303.

[5]ZHAO Ziyi， YANG Lei， MU Xiaohong， ?et al. ?Cajanine promotes osteogenic differentiation and proliferation of human bone marrow mesenchymal stem cells[J]. ?Adv Clin Exp Med， 2018. doi：10.17219/acem/76638.

[6]OMLOR G W， LORENZ S， NERLICH A G， ?et al. ?Disc cell therapy with bone`-marrow`-derived autologous mesenchymal stromal cells in a large porcine disc degeneration model[J]. ?Eur Spine J， 2018. doi：10.1007/s00586`-018`-5728`-4.

[7]王昌耀，王英振. 骨髓間充質干細胞向軟骨細胞表型分化的影響因素[J]. ?青島大學醫學院學報， 2007，43（1）：85`-88.

[8]KARIMAGHAI N， TAMADON A， RAHMANIFAR F， ?et al. ?Spermatogenesis after transplantation of adipose tissue`-derived mesenchymal stem cells in busulfan`-induced azoospermic hamster[J]. ?Iran J Basic Med Sci， 2018，21（7）：660`-667.

[9]FUTREGA K， MOSAAD E， CHAMBERS K， ?et al. ?Bone marrow`-derived stem/stromal cells （BMSC） 3D microtissues cultured in BMP`-2 supplemented osteogenic induction medium are prone to adipogenesis[J]. ?Cell Tissue Res， 2018. doi：10.1007/s00441`-018`-2894`-y.

[10]孟飛，呂成昱，張海寧，等. ?轉化生長因子`-β3與基質金屬蛋白酶抑制劑`-2聯合轉染兔骨髓間充質干細胞復合絲素蛋白/殼聚糖生物支架修復兔軟骨缺損[J]. ?中華實驗外科雜志， 2015，32（7）：1522`-1526.

[11]CEVENINI A， ORRU S， MANCINI A， ?et al. ?Molecular signatures of the insulin`-like growth factor 1`-mediated epithelial`-mesenchymal transition in breast， lung and gastric cancers[J]. ?Int J Mol Sci， 2018，19（8）. doi：10.3390/ijms19082411.

[12]MEEPHANSAN J， UNGPRAPHAKORN N， PONNIKORN S， ?et al. ?Efficacy of 1 550 nm erbium`-glass fractional laser treatment and its effect on the expression of insulin`-like growth factor 1 and Wnt/β`-Catenin in androgenetic alopecia[J]. ?Dermatol Surg， 2018.doi：10.1097/DSS.00000000000016`-19.

[13]PHILLIPS G M， SHORTEN P R， WAKE G C， ?et al. ?Mode`-ling the effect of insulin`-like growth factor`-1 on human cell growth[J]. ?Math Biosci， 2015，259（12）：43`-54.

[14]馬子陽，吳獻毅，張彥軍，等. 胰島素樣生長因子1對2型糖尿病合并骨質疏松中骨鈣素表達的影響[J]. ?中國骨質疏松雜志， 2018，24（5）：686`-689.

[15]黃驍燕，張茵，胡蓓，等. 瘦素、胰島素樣生長因子`-1和胰島素樣生長因子結合蛋白`-3在絕經后骨質疏松患者血清中的表達及意義[J]. ?中國婦幼保健， 2018，33（9）：2056`-2058.

[16]馬志勇. 組織工程軟骨支架材料研究熱點與軟骨運動損傷的修復[J]. ?中國組織工程研究與臨床康復， 2010，14（51）：9667`-9670.

[17]方洪松，周建林，彭昊，等. 組織工程支架材料修復關節軟骨缺損[J]. ?中國組織工程研究， 2016，20（52）：7891`-7898.

[18]MOUSA H S E， ABDEL AAL S M， ABBAS N A T. Umbilical cord blood`-mesenchymal stem cells and carvedilol reduce doxorubicin`-induced cardiotoxicity： possible role of insulin`-like growth factor`-1[J]. ?Biomed Pharmacother， 2018，105：1192`-1204.

[19]WANG Zheng， LI Wenting， GUO Qiongya， ?et al. ?Insulin`-like growth factor`-1 signaling in lung ?development and inflammatory lung diseases[J]. ?Biomed Res Int， 2018， 2018（3）：1`-27.

[20]鄔波，馬旭，朱大木，等. 胰島素樣生長因子`-1對骨髓間充質干細胞軟骨分化及基質金屬蛋白酶表達的影響[J]. ?中國組織工程研究， 2013，17（19）：3421`-3429.

[21]周全，鄧展生，朱勇，等. 胰島素樣生長因子1對人脂肪來源的間充質干細胞向軟骨細胞定向誘導分化的作用[J]. ?中國組織工程研究與臨床康復， 2010，14（10）：1785`-1790.

[22]ZHANG Hui， MA Xun， ZHANG Li， ?et al. ?The ability to form cartilage of NPMSC and BMSC in SD rats[J]. ?Int J Clin Exp Med， 2015，8（4）：4989`-4996.

[23]LIU Pengcheng， LIU Kuan， LIU Junfeng， ?et al. ?Transfection of the IHH gene into rabbit BMSCs in a simulated microgravity environment promotes chondrogenic differentiation and inhibits cartilage aging[J]. ?Oncotarget， 2016，7（39）：62873`-62885.

[24]KANG Ning， LIU Xia， GUAN Yue，?et al.?Effects of co`-culturing BMSCs and auricular chondrocytes on the elastic modulus and hypertrophy of tissue engineered cartilage[J].?Biomate`-rials， 2012，33（18）：4535`-44.

[25]HOLAN V， CECHOVA K， ZAJICOVA A，?et al.?The impact of morphine on the characteristics and function properties of human mesenchymal stem cells[J].?Stem Cell Rev， 2018. doi：10.1007/s12015`-018`-9843`-8.

[26]GU Xianliang， YU Xi， ZHAO Chen，?et al.?Efficacy and safety of autologous bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in patients with diabetic retinopathy[J].?Cell Physiol Biochem， 2018，49（1）：40`-52.

[27]顧蕊，陳伯華. 外源性骨髓間充質干細胞在兔椎間盤內存活狀態觀察[J].?青島大學醫學院學報， 2009，45（5）：447`-448，452.

[28]CHEN W， CHEN S， MORSI Y，?et al.?Superabsorbent 3D scaffold based on electrospun nanofibers for cartilage tissue[J].?Engineering. ACS Applied Materials & Interfaces， 2016，8（37）：24415`-24425.

[29]李華，陸戰新，楊晶. 基于CAD與3D打印技術設計制作的緩釋PDGF`-BB/HA`-PLA/纖維蛋白膠三維復合支架在骨缺損治療領域的實驗研究[J].?中國數字醫學， 2018，13（3）：92`-95.