鈣結合蛋白S100B對骨性關節炎模型兔軟骨損傷修復中炎性遞質表達影響

王金鋒　李春勝　畢前航　楚曉豐　張海寧

[摘要]目的探討鈣結合蛋白S100B對骨性關節炎（OA）模型兔軟骨損傷修復中炎性遞質表達的影響及其機制。方法應用膝關節制動法制備兔OA模型。采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）方法分別檢測兔關節液中白細胞介素`-1β（IL`-1β）、腫瘤壞死因子`-α（TNF`-α）水平，用Real`-time PCR（RT`-PCR）方法及Western blot法檢測兔軟骨組織中S100B、成纖維細胞生長因子（FGF2）及成纖維細胞生長因子受體1（FGFR1）的表達。利用小干擾RNA（siRNA）技術，構建S100B的siRNA干擾載體和過表達載體以及FGFR1的siRNA干擾載體，用慢病毒轉染方法，將S100B的siRNA干擾載體和過表達載體以及FGFR1的siRNA干擾載體轉入人滑膜成纖維細胞內。采用ELISA方法檢測各組滑膜成纖維細胞中IL`-1β和TNF`-α水平，用RT`-PCR和Western blot法檢測FGF2和FGFR1的表達。結果與對照組比較，模型組兔關節液中IL`-1β、TNF`-α水平顯著增加（t=4.042、6.408，P<0.05），兔軟骨組織中S100B、FGF2、FGFR1表達顯著增加（t=4.091～7.229，P<0.05）。S100B過表達及干擾實驗顯示，LPS+vehicle control組、LPS+S100B過表達組細胞IL`-1β、TNF`-α水平較空白對照組升高，且LPS+S100B過表達組高于LPS+vehicle control組，差異均有統計學意義（F=32.019、27.377，P<0.05）;而LPS+S100B siRNA組細胞IL`-1β、TNF`-α水平與空白對照組比較差異無統計學意義（P>0.05）。FGFR1拮抗實驗顯示，LPS+vehicle control組、LPS+S100B過表達組細胞IL`-1β、TNF`-α水平較空白對照組升高，且LPS+S100B過表達組高于LPS+vehicle control組，差異均有統計學意義（F=30.548、20.244，P<0.05）;LPS+S100B過表達+FGFR1 siRNA組細胞IL`-1β、TNF`-α水平雖高于空白對照組，但差異無統計學意義（P>0.05）。LPS+S100B過表達+FGFR1 siRNA組細胞FGF2表達較空白對照組顯著升高（F=11.002、13.147，P<0.05），但FGFR1表達與空白對照組比較差異無統計學意義（P>0.05）。結論鈣結合蛋白S100B能夠調節滑膜成纖維細胞炎癥反應并可能影響OA軟骨損傷修復，其機制可能與激活FGF2/FGFR1信號通路有關。

[關鍵詞]鈣結合蛋白質類;骨關節炎;軟骨，關節;成纖維細胞生長因子;受體，成纖維細胞生長因子;兔

[ABSTRACT]ObjectiveTo explore the effect of calcium binding protein S100B on the expression of inflammatory mediators in the repair of cartilage injury in a rabbit model of osteoarthritis （OA） and its mechanism. MethodsA rabbit model of OA was prepared by knee joint immobilization. Enzyme`-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to determine the levels of interleukin`-1 beta （IL`-1β） and tumor necrosis factor`-alpha （TNF`-α） in the synovial fluid of rabbits; real`-time PCR and Western blot were used to determine the expression of S100B， fibroblast growth factor 2 （FGF2）， and fibroblast growth factor receptor 1 （FGFR1） in the cartilage tissue of rabbits. Small interfering RNA （siRNA） technique was applied to construct the siRNA interfe`-rence vector and over`-expression vector for S100B and the siRNA interference vector for FGFR1， all of which were then transfected into human synovial fibroblasts by lentivirus transfection. ELISA was used to determine the levels of IL`-1β and TNF`-α in synovial fibroblasts in each group， and RT`-PCR and Western blot were used to determine the expression of FGF2 and FGFR1. ResultsCompared with the control group， the model group had significantly increased levels of IL`-1β and TNF`-α in the synovial fluid of rabbits （t=4.042 and 6.408， respectively，P<0.05） as well as significantly increased expression of S100B， FGF2， and FGFR1 in the cartilage tissue of rabbits （t=4.091-7.229，P<0.05）. The over`-expression and interference experiments of S100B revealed the following： compared with the blank control group， the LPS+vehicle control group and the LPS+S100B over`-expression group had signi`-ficantly increased levels of IL`-1β and TNF`-α， with significantly hig`-her levels observed in the LPS+S100B over`-expression group than?the LPS+vehicle control group （F=32.019 and 27.377， respectively，P<0.05）， while there were no significant differences in the levels of IL`-1β and TNF`-α between the LPS+S100B siRNA group and the blank control group （P>0.05）. The antagonistic experiment of FGFR1 showed the following： compared with the blank control group， the LPS+vehicle control group and the LPS+S100B over`-expression group had significantly increased levels of IL`-1β and TNF`-α， with significantly higher levels observed in the LPS+S100B over`-expression group than the LPS+vehicle control group （F=30.548 and 20.244， respectively，P<0.05）; while the LPS+S100B over`-expression+FGFR1 siRNA group had higher levels of IL`-1β and TNF`-α than the blank control group， the differences between groups were not significant （P>0.05）. Compared with the blank control group， the LPS+S100B over`-expression+FGFR1 siRNA group had significantly increased expression of FGF2 （F=11.002 and 13.147， respectively，P<0.05）， but the expression of FGFR1 was not significant different between the two groups （P>0.05）. ?ConclusionCalcium binding protein S100B can regulate the inflammatory response of synovial fibroblasts and may affect the repair of cartilage injury in OA， which may be related to the FGF2/FGFR1 signaling pathway.

[KEY WORDS]calcium`-binding proteins; osteoarthritis; cartilage， articular; fibroblast growth factors; receptors， fibroblast growth factor; rabbits

骨性關節炎（OA）是由于關節軟骨變性、骨質增生而引起的一種慢性進行性骨關節疾病，其發病機制尚不明確[1`-2]。流行病學資料顯示，55歲以上人群OA的發病率為44%～70%，65歲以上人群OA的發病率高達60%～70%[3`-4]。我國目前約有1.5億OA病人，其中50%～70%的病人急需治療。所以OA發病機制的研究對于疾病的臨床防治具有十分重要的意義。研究結果表明，滑膜炎癥反應是OA發病的早期階段，滑膜炎癥反應時關節液中的炎癥因子，如白細胞介素`-1β（IL`-1β）、腫瘤壞死因子`-α（TNF`-α）等，能夠引起軟骨細胞的肥大和細胞外基質的降解，最終導致軟骨組織破壞[5`-7];同時，滑膜成纖維細胞（SF）也被激活，SF能夠通過釋放成纖維細胞生長因子（FGF2）與成纖維細胞生長因子受體1（FGFR1）相互作用，來激活多種信號通路，調節滑膜炎癥反應，從而影響軟骨損傷修復[8`-9]。S100B是S100鈣結合蛋白家族成員之一，研究認為其與細胞的增殖、分化、凋亡密切相關[10`-12]。近年來，S100家族分子與滑膜炎和OA之間的關系越來越受到關注，但是有關S100B在OA發生發展中的作用研究尚不多見。本研究通過檢測兔關節炎模型S100B表達的變化，并通過在SF中過表達和干擾S100B的表達，觀察其對炎癥因子IL`-1β和TNF`-α表達水平及FGF2/FGFR1通路分子表達水平的影響，探討S100B在OA軟骨損傷修復中的作用及其機制。

1材料與方法

1.1軟骨損傷動物模型制備

取20只健康成年新西蘭兔（購自上海中國科學院實驗動物中心），隨機分為對照組和模型組。模型組兔右膝關節用管型石膏制動4周，對照組兔不做任何處理。4周后，分別取兩組兔的關節液及軟骨組織用于后續炎癥因子及相關蛋白水平的檢測。

1.2人SF的分離培養

關節鏡下取正常人外傷后的膝關節滑膜組織，無菌條件下剪碎，用2 g/L的Ⅱ型膠原蛋白酶消化2 h，2.5 g/L胰蛋白酶消化5 min，胎牛血清終止消化，1 000 r/min離心5 min，棄去上層液體，加入含體積分數0.10胎牛血清的DMEM培養液，用100目篩網過濾，調整細胞密度至4×108/L，轉移至細胞培養瓶內，置37 ℃、含體積分數0.05 CO2培養箱中培養。隔3 d更換培養液，待細胞生長至85%融合時，用2.5 g/L胰酶消化、傳代。收集第3～5代細胞用于后續實驗。

1.3慢病毒介導人SF中S100B的過表達和干擾

將上述培養的細胞用慢病毒實現S100B的過表達和干擾，過表達和干擾S100B、干擾FGFR1及相應對照的慢病毒細胞株購自上海漢恒生物科技有限公司。將細胞接種到6孔板中，待融合度達30%時，按照轉染復數（MOI）=50轉染慢病毒，轉染36 h后，在倒置光學顯微鏡下觀察轉染效率。

1.4實驗分組

在S100B過表達及干擾實驗中分組如下。空白對照組（A1組）：不做任何處理;LPS+vehicle control組（B1組）：用無序列載體陰性對照慢病毒處理人SF后加20 μg/L的LPS;LPS+S100B過表達組（C1組）：用S100B過表達慢病毒處理人SF后加入20 μg/L的LPS;LPS+S100B siRNA組（D1組）：用S100B干擾慢病毒處理人SF后加入20 μg/L的LPS。在FGFR1拮抗實驗中的分組如下。空白對照組（A2組）：不做任何處理;LPS+vehicle control組（B2組）：用無序列載體陰性對照慢病毒處理人SF后加入20 μg/L的LPS;LPS+S100B過表達組（C2組）：用S100B過表達慢病毒處理人SF鈣結合蛋白S100B對骨性關節炎模型兔軟骨損傷修復中炎性遞質表達影響143后加20 μg/L的LPS;LPS+S100B過表達+FGFR1 siRNA組（D2組）：應用S100B過表達以及FGFR1 siRNA慢病毒處理人SF后加20 μg/L的LPS。

1.5酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法檢測炎癥因子的表達

采用ELISA法對兔關節液中和處理后人SF中IL`-1β和TNF`-α的表達水平進行測定。檢測采用R&D公司生產的試劑盒，按照說明書進行操作。

1.6Real`-time PCR方法檢測S100B、FGF2和FGFR1 mRNA的表達

用Trizol抽提總RNA。用PrimeScript RT試劑盒（Promega公司）進行逆轉錄。采用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq在ABI 7500擴增儀上進行定量PCR，PCR反應條件如下：94 ℃、4 min，94 ℃、40 s，52 ℃、40 s，72 ℃、40 s，共40個循環。PCR結果分析采用2-△△Ct法。

1.7Western blot法檢測S100B、FGF2和FGFR1蛋白表達

將各組的軟骨組織和人SF蛋白用SDS`-PAGE凝膠進行電泳并轉至PVDF膜上，然后將PVDF膜以50 g/L的脫脂牛奶封閉，再分別采用anti`-S100、anti`-FGF2以及anti`-FGFR1單克隆抗體進行孵育，以GAPDH單克隆抗體作為內參。采用化學發光法檢查蛋白，所獲得的蛋白條帶采用Image J軟件進行定量。

1.8統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，所得計量資料數據以±s表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗;多組比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用LSD`-t檢驗。

2結果

2.1兩組兔關節液中IL`-1β和TNF`-α水平比較

與對照組比較，模型組兔關節液中IL`-1β和TNF`-α表達水平顯著增加，差異有統計學意義（t=4.042、6.408，P<0.05）。見表1。

2.2兩組兔軟骨組織中S100B、FGF2和FGFR1表達比較

與對照組比較，模型組兔軟骨組織中S100B、FGF2和FGFR1的表達均顯著增加，差異有統計學意義（t=4.091～7.229，P<0.05）。見表2。

2.3過表達和干擾S100B對SF細胞IL`-1β、TNF`-α水平的影響

與空白對照組比較，LPS+vehicle control組、LPS+S100B過表達組細胞IL`-1β、TNF`-α水平顯著升高，且LPS+S100B過表達組高于LPS+vehicle control組，差異均有顯著意義（F=32.019、27.377，P<0.05）;而LPS+S100B siRNA組細胞IL`-1β、TNF`-α水平與空白對照組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。

2.4過表達和干擾S100B對SF細胞中FGF2和FGFR1表達的影響

與空白對照組比較，LPS+vehicle control組、LPS+S100B過表達組細胞FGF2、FGFR1的表達顯著升高，且LPS+S100B過表達組高于LPS+vehicle control組，差異均有顯著意義（F=13.221～19.892，P<0.05）;而LPS+S100B siRNA組細胞FGF2、FGFR1的表達與空白對照組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表4。

2.5FGFR1 siRNA對SF細胞IL`-1β、TNF`-α水平的影響

與空白對照組比較，LPS+vehicle control組、LPS+S100B過表達組細胞IL`-1β、TNF`-α水平顯著升高，且LPS+S100B過表達組高于LPS+vehicle control組，差異均有顯著意義（F=30.548、20.244，P<0.05）;LPS+S100B過表達+FGFR1 siRNA組細胞IL`-1β、TNF`-α水平雖高于空白對照組，但差異無統計學意義（P>0.05）。見表5。

2.6FGFR1 siRNA對SF細胞FGF2、FGFR1表達的影響

與空白對照組比較，LPS+vehicle control組、LPS+S100B過表達組細胞FGF2、FGFR1的表達顯著升高，差異有統計學意義（F=11.002～30.148，P<0.05）;LPS+S100B過表達+FGFR1 siRNA組細胞FGF2的表達較空白對照組也顯著升高（F=11.002、13.147，P<0.05），但FGFR1的表達與空白對照組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表6。

3討論

OA在臨床上主要表現為關節疼痛、活動受限和畸形，致殘率較高，嚴重影響病人的生活質量[13]。鎮痛、抗炎藥物是目前臨床治療OA的主要手段，然而這些藥物僅能減輕病人的痛苦，在延緩疾病的進展上作用不大。晚期OA病人需行全關節置換手術，這增加了病人的痛苦和經濟負擔[14`-15]。因此，探索OA的發病機制，尋找延緩或阻止OA發生、發展的治療靶點，對于疾病的早期防治至關重要。關節軟骨內無血管、淋巴管和神經支配，主要靠關節腔內的滑膜液維持營養，所以損傷后較難修復[4，16]。關節軟骨機械磨損后啟動了炎癥遞質介導的關節組織異常重建過程是導致OA的主要原因，該過程主要包括關節軟骨細胞凋亡和滑膜組織無菌性炎癥兩方面[17`-19]。S100B是S100鈣結合蛋白家族成員之一，與生物機械力學信號的傳遞密切相關，尤其在機械磨損導致的軟骨細胞凋亡和滑膜組織炎癥中發揮重要作用[20`-21]。然而，S100B在OA進展過程中的具體作用以及其下游信號通路尚不明確。

既往研究認為，FGF2具有促進軟骨細胞增殖和軟骨修復的作用[22`-23]。然而也有研究認為，FGF2的促細胞分裂作用并沒有致力于軟骨細胞的再生，反而參與了軟骨基質的降解。WANG等[24]的研究結果表明，FGF2可以通過MEK/ERK 信號通路激活RUNX2，從而上調OA病人關節軟骨細胞基質金屬蛋白酶`-13（MMP`-13）的表達，促進細胞外基質降解。SCHMAL等[25]研究結果表明，FGF2可降低關節軟骨細胞中Ⅱ型膠原蛋白酶含量，導致軟骨細胞纖維化。此外，FGF2還能通過ERK1/2、p38、JNK或NF`-κb/Elk`-1等途徑刺激關節軟骨細胞高表達MMP`-13 [26`-27]。FGFRs屬于酪氨酸蛋白激酶家族，是FGFs的受體。一般認為，FGFR1和FGFR3表3過表達和干擾S100B對SF細胞IL`-1β、TNF`-α表達影響（n=5，ρ/ng·L-1，±s）組別IL`-1β TNF`-α A1組10.5±1.775.3±10.2B1組32.7±3.4*174.7±20.3*C1組84.5±7.1*301.5±48.2*D1組15.1±2.178.1±9.9與A1組比較，*F=27.377、32.019，P<0.05。

是調節關節軟骨代謝的關鍵受體[28]。而FGFR1和FGFR3 均能夠被FGF2 激活。YAN等[29]研究顯示，FGFR1信號主要是促進關節軟骨細胞的凋亡。本研究以FGF2/FGFR1信號通路為S100B的下游信號通路進行機制研究，通過調節SF細胞中S100B的表達，觀察其對FGF、FGFR1、IL`-1β、TNF`-α等的影響，探討其在關節軟骨損傷修復中作用。本文結果顯示，軟骨損傷模型兔關節軟骨組織中S100B、FGF2、FGFR1的表達明顯增加，關節液中IL`-1β、TNF`-α水平明顯增加。其結果提示S100B、FGF2、FGFR1、IL`-1β和TNF`-α參與了OA軟骨損傷修復過程。推測其可能作用機制為：S100B誘導SF分泌FGF2等細胞因子，細胞因子與FGFR1受體結合后激活多種信號通路，調節IL`-1β、TNF`-α等炎性細胞因子的表達，調節滑膜炎癥反應，從而參與OA軟骨損傷修復。為進一步證實該推測，本研究體外培養SF細胞，通過過表達、干擾S100B和拮抗FGFR1表達，觀察其對炎癥因子IL`-1β和TNF`-α水平及FGF2/FGFR1通路分子表達水平的影響。結果顯示，過表達S100B使FGF2、FGFR1表達和IL`-1β、TNF`-α水平增加，而干擾S100B表達則使FGF2、FGFR1表達以及IL`-1β、TNF`-α水平均降低;過表達S100B同時拮抗FGFR1表達時，FGF2的表達較空白對照組顯著增加，而FGFR1和IL`-1β、TNF`-α水平均較空白對照組降低，差異具有統計學意義。說明S100B是通過激活FGF2/FGFR1信號通路上調IL`-1β、TNF`-α表達，從而加劇軟骨損傷。所以，干擾S100B或拮抗FGFR1表達能夠促進關節軟骨損傷修復。

綜上所述，S100B蛋白能夠調節SF細胞炎癥反應，進而影響OA軟骨損傷修復，其機制可能與激活FGF2/FGFR1信號通路有關。

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