Slit2促進(jìn)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的作用

劉文忠　蔡靜　李軍　榮春　范磊　張海寧

[摘要]目的探究慢病毒介導(dǎo)分泌型糖蛋白神經(jīng)生長導(dǎo)向因子2（Slit2）過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用。方法利用基因過表達(dá)技術(shù)，構(gòu)建Slit2過表達(dá)載體;慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs;利用流式細(xì)胞儀檢測BMSCs的表面蛋白，RT`-PCR和Western`-blot方法檢測空白對照組、空載體病毒組和過表達(dá)載體病毒組神經(jīng)細(xì)胞表面蛋白膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）和神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）的表達(dá)。結(jié)果第2代BMSCs表面CD44、CD29、CD34和CD45的表達(dá)率分別為60.2%、58.3%、3.4%和2.6%，慢病毒轉(zhuǎn)染效率為90%以上。空白對照組、空載體病毒組和過表達(dá)載體病毒組的GFAP、NSE mRNA和蛋白相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=9.089～13.893，P<0.05）;其中過表達(dá)載體病毒組的GFAP、NSE mRNA和蛋白相對表達(dá)量明顯高于空載體病毒組（P<0.05），空載體病毒組和空白對照組比較差異無顯著性（P>0.05）。結(jié)論Slit2過表達(dá)質(zhì)粒可以提高BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的效率，為神經(jīng)損傷和脊髓損傷提供種子細(xì)胞。

[關(guān)鍵詞]神經(jīng)生長因子;骨髓;間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞;神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白質(zhì);磷酸丙酮酸水合酶

[ABSTRACT]ObjectiveTo explore the effect of lentivirus`-mediated overexpression of Slit2 on the transformation of bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） into neural cells. MethodsA Slit2 overexpression vector was constructed and used to transfect BMSCs via lentivirus. Flow cytometry was used to detect surface proteins of BMSCs. RT`-PCR and Western blot were used to determine the expression of glial fibrillary acidic protein （GFAP） and neuron`-specific enolase （NSE） on the surface of neural cells in blank control group， empty lentiviral vector group， and overexpression lentiviral vector group. ResultsThe expression of CD44， CD29， CD34， and CD45 was 60.2%， 58.3%， 3.4%， and 2.6%， respectively， on the surface of the second generation BMSCs. The transfection efficiency of lentivirus was over 90%. There were significant differences in relative mRNA and protein expression of GFAP and NSE between the blank control group， the empty lentiviral vector group， and the overexpression lentiviral vector group （F=9.089-13.893，P<0.05）. The overexpression lentiviral vector group had significantly higher relative mRNA and protein expression of GFAP and NSE than the blank control group and the empty lentiviral vector group （P<0.05）， while there were no significant differences between the blank control group and the empty lentiviral vector group （P>0.05）. ConclusionThe Slit2 overexpression plasmid can promote the efficiency of the transformation of BMSCs into neural cells， which provide seed cells for nerve injury and spinal cord injury.

[KEY WORDS]nerve growth factor; bone marrow; mesenchymal stromal cells; ?glial fibrillary acidic protein; phosphopyruvate hydratase

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）具有多向分化潛能，在特定環(huán)境下，可以分化成人體內(nèi)的各種細(xì)胞，比如軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞以及神經(jīng)細(xì)胞等[1`-4]。研究結(jié)果顯示，BMSCs在特定誘導(dǎo)條件下可以轉(zhuǎn)化成神經(jīng)細(xì)胞，進(jìn)而能促進(jìn)神經(jīng)損傷的修復(fù);而且BMSCs來源于病人自體，移植后可以避免排斥反應(yīng)[5];另外，BMSCs能分泌多種細(xì)胞因子，這為神經(jīng)的修復(fù)提供了一個新的思路[6]。分泌型糖蛋白神經(jīng)生長導(dǎo)向因子2（Slit2）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的一種軸突導(dǎo)向抑制因子，可控制神經(jīng)軸突分支形成以及神經(jīng)細(xì)胞遷移，能促進(jìn)BMSCs向感覺神經(jīng)元分化，參與損傷神經(jīng)再生和功能修復(fù)[7`-9]。近年來，在交通事故中發(fā)生的神經(jīng)損傷和脊髓損傷比較常見，而針對神經(jīng)損傷的治療一直是臨床上的難點。本研究將Slit2過表達(dá)載體以慢病毒介導(dǎo)入BMSCs內(nèi)，探討慢病毒介導(dǎo)Slit2過表達(dá)轉(zhuǎn)染促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用，從而為臨床神經(jīng)損傷病人治療提供新的思路。

1材料與方法

1.1實驗材料

胎牛血清購自Gibco公司;DMEM及2.5 g/L胰酶Trypsin購自美國Invitrogen公司;Trizol購自美國Invitrogen公司;氯仿、乙醇及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國ABI Applied Biosystems公司;Real`-time PCR儀購自美國bio`-rad公司。

1.2實驗方法

1.2.1人BMSCs的分離和培養(yǎng)選取20名健康志愿者，男8例，女12例，年齡為20～38歲，平均（27.48±7.83）歲。實驗方案獲得了本院倫理委員會的批準(zhǔn)，所有志愿者均簽署知情同意書。志愿者術(shù)前查體，排除肝炎、性病、艾滋病等傳染性疾病;術(shù)中取俯臥位，暴露雙側(cè)髂后上棘，消毒，鋪巾，以利多卡因20 mL局部麻醉，利用骨穿刺針采集志愿者的新鮮骨髓，按照1∶3體積比加入含0.01 mol/L胎牛血清、100 kU/L青霉素的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，充分混勻后，移入25 cm2的Hank培養(yǎng)瓶中，采用差速培養(yǎng)法培養(yǎng)，3 d后去掉培養(yǎng)瓶中的油脂等雜質(zhì)，之后每3 d換1次細(xì)胞培養(yǎng)液。BMSCs細(xì)胞融合率達(dá)70%～80%后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2BMSCs的鑒定采用流式細(xì)胞儀檢測第2代BMSCs表面蛋白CD29、CD44、CD71、CD90和CD106的表達(dá);采用倒置光學(xué)顯微鏡觀察BMSCs的細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3慢病毒Slit2過表達(dá)載體構(gòu)建慢病毒Slit2過表達(dá)載體由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成，選擇pHBLV`-U6`-ZsGreen`-PGK`-Puro作為質(zhì)粒克隆載體。慢病毒Slit2過表達(dá)載體克隆切入點為XhoI/BamHI，編號為ENST00000005893。

1.2.4慢病毒細(xì)胞轉(zhuǎn)染和實驗分組取第3代BMSCs進(jìn)行實驗。將細(xì)胞接種到6孔板，待細(xì)胞融合率為50%時進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，根據(jù)轉(zhuǎn)染說明書，MOI=50，慢病毒滴度為3×107。將BMSCs細(xì)胞分成3組?？瞻讓φ战M：未轉(zhuǎn)染慢病毒;空白載體慢病毒組：轉(zhuǎn)染不含Slit2過表達(dá)載體慢病毒;Slit2過表達(dá)載體慢病毒組：轉(zhuǎn)染Slit2過表達(dá)載體慢病毒。

1.2.5實時熒光定量PCR（RFPCR）檢測神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白質(zhì)（GFAP）和神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）mRNA表達(dá)3組細(xì)胞融合率達(dá)80%，用2.5 g/L胰蛋白酶消化后放入15 mL離心管中，加入1 mL的Trizol RNA iso（Takara，日本），利用Trizol萃取法，提取總RNA。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄目的RNA，將得到的cDNA保存在-80 ℃冰箱中。根據(jù)熒光定量PCR試劑盒說明書要求，反應(yīng)體系為25 μL，內(nèi)含：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（2×） 12.5 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L） 1.0 μL， PCR Reverse Primer（10 μmol/L） 1.0 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。應(yīng)用FS 2000系統(tǒng)PCR儀器對25 μL的反應(yīng)體系進(jìn)行分析，采用兩步法PCR反應(yīng)程序，反應(yīng)時間選擇120 min;其中預(yù)變性：95 ℃、30 s;Circle 1：95 ℃、30 s;Circle 2：60 ℃、30 s;溶解曲線：95 ℃、5 s， 60 ℃ 1 min;降溫： 50 ℃、30 s。記錄各樣本的CT值。內(nèi)參基因引物由上海生工公司合成。見表1。用2-△△CT法計算GAPDH、GFAP和NSE的相對表達(dá)量。

1.2.6Western`-blot檢測GFAP和NSE的相對蛋白表達(dá)水平3組細(xì)胞處理后，分別加入RIPA細(xì)胞裂解液1 mL，在冰上裂解30 min，收集入1.5 mL的離心管中，在4 ℃預(yù)冷的離心機(jī)中離心（5 000 r/min，5 min），提取上清，經(jīng)95 ℃煮沸后，收集蛋白備用。制備濃縮膠10 mL，分離膠20 mL。上樣后電泳分離，轉(zhuǎn)膜后在4 ℃冰箱中避光孵育過夜（>12 h）。GFAP和NSE小鼠抗人一抗（Abcam公司）1∶10 000稀釋后加入樣本離子膜;第2天用PBST稀釋液洗膜，重復(fù)3次，用山羊抗小鼠IgG二抗（碧云天公司）1∶1 000稀釋后孵育1.5 h，使用PBST稀釋液洗膜，重復(fù)3次，然后用DAB顯影液進(jìn)行顯影。應(yīng)用Image J軟件分析蛋白條帶。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料結(jié)果以±s形式表示。多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。

2結(jié)果

2.1人BMSCs的培養(yǎng)和鑒定

接種48 h后，原代BMSCs開始貼壁，細(xì)胞呈梭

2期劉文忠，等. Slit2促進(jìn)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的作用139

形或者多角形;培養(yǎng)至第2代細(xì)胞呈旋渦狀或者輻射狀生長，細(xì)胞增殖迅速。流式細(xì)胞儀檢測顯示，第2代BMSCs表面蛋白CD44和CD29表達(dá)率分別為60.2%和58.3%，CD34和CD45表達(dá)率分別為3.4%和2.6%。

2.2慢病毒介導(dǎo)Slit2過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs

結(jié)果顯示，慢病毒的轉(zhuǎn)染效率較高，為90%以上，可以在最大程度上發(fā)揮Slit2的過表達(dá)作用。

2.3各組GFAP、NSE mRNA和蛋白表達(dá)比較

空白對照組、空載體病毒組和過表達(dá)載體病毒組的GRAP、NSE mRNA水平和蛋白表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=9.089～13.893，P<0.05），其中空載體病毒組和空白對照組比較差異無顯著性（P>0.05）;過表達(dá)載體病毒組和空載體病毒組相比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（q=2.001～3.897，P<0.05）。見表2。

3討論

近年來，隨著交通事故的多發(fā)，在交通事故中發(fā)生的神經(jīng)損傷和脊髓損傷比較常見[10`-12]，而針對神經(jīng)損傷的治療一直是臨床上的難點[13]。BMSCs具有多分化潛能，最近有研究表明，BMSCs可以分化成神經(jīng)細(xì)胞[14`-18]。在神經(jīng)導(dǎo)向因子Slit2的刺激下，BMSCs可轉(zhuǎn)化成神經(jīng)細(xì)胞，但是效率不高[19`-20]。本研究利用基因過表達(dá)技術(shù)，構(gòu)建Slit2的過表達(dá)載體，再利用高轉(zhuǎn)染效率的慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs，探討B(tài)MSCs向神經(jīng)細(xì)胞高效率轉(zhuǎn)化的實驗方法，為臨床上神經(jīng)損傷和脊髓損傷提供種子細(xì)胞。

Slit2是神經(jīng)發(fā)育過程中引起神經(jīng)細(xì)胞生長的神經(jīng)導(dǎo)向因子[21]。有研究結(jié)果表明，Slit2通過濃度梯度來介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的遷移和生長，對神經(jīng)細(xì)胞的生長起排斥性導(dǎo)向作用，同時還可促進(jìn)感覺神經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)纖維分支形成[22`-24]。提示神經(jīng)生長因子可以促進(jìn)神經(jīng)元譜系細(xì)胞的分化[25]。本研究應(yīng)用基因過表達(dá)技術(shù)構(gòu)建Slit2過表達(dá)載體，應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs，結(jié)果顯示，慢病毒的轉(zhuǎn)染效率較高，為90%以上，可以最大程度發(fā)揮Slit2的過表達(dá)作用。

GFAP和NSE均是神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)識蛋白，其中GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志物，主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，參與細(xì)胞骨架的構(gòu)成并維持其張力強(qiáng)度[26`-27]。血清NSE是神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞所特有的一種酸性蛋白酶[28]。本研究選用以上兩種神經(jīng)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，采用RT`-PCR和Western`-blot的實驗方法，從基因和蛋白兩個層面上檢測空白對照組、空載體病毒組和過表達(dá)載體病毒組的GRAP和NSE的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，過表達(dá)載體病毒組GRAP和NSE基因和蛋白的表達(dá)水平均明顯高于空載體病毒組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。從而可以證明從基因水平上將Slit2的過表達(dá)載體通過慢病毒介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染BMSCs，可以提高BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率，故而神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)記物GFAP和NES的表達(dá)量明顯增高。

綜上所述，Slit2過表達(dá)質(zhì)?？梢蕴岣連MSCs向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的效率，為臨床上神經(jīng)損傷和脊髓損傷治療提供種子細(xì)胞。

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