“GOTI”技術讓基因編輯脫靶無處遁形

[本刊訊]中國科學院神經科學研究所中國科學院靈長類神經生物學重點實驗室楊輝研究組與中國科學院計算生物學研究所等單位合作，建立了一種新型基因編輯脫靶檢測技術，名為“二細胞胚胎注射法全基因組脫分析”（genome-wide off-target analysis by two-cell embryo injection，GOTI），并用該技術發現單堿基編輯有可能導致大量無法預測的脫靶，有嚴重安全風險。該研究顯著提高了脫靶檢測的敏感性，可不借助任何脫靶位點預測技術發現以往檢測手段無法檢出的完全隨機的脫靶位點。2019年3月1日成果以題為“胞嘧啶單堿基編輯會導致大量單核苷酸突變脫靶”的研究論文發表于Science。

新一代基因編輯工具CRISPR/Cas9從發明以來，一直以高效性和特異性備受關注，學界普遍認為基于CRISPR/Cas9及其衍生工具的臨床技術將為人類健康做出巨大貢獻。但該技術問世以來，其脫靶風險一直備受關注，如將它及其衍生工具用于臨床，脫靶效應可能會引發包括癌癥在內的很多不良反應。此前推出過多種檢測脫靶的方案，它們或者依賴于計算機軟件預測，或者依賴于高通量測序檢測是否發生雙鏈DNA斷裂，以及其他體外檢測法。但這些方法都不能高靈敏度地檢測到脫靶引起的突變，尤其是堿基突變，故對CRISPR/Cas9及其衍生工具的真實脫靶率一直存有爭議，尋求既不依賴于脫靶位點預測又具足夠信噪比的精確脫靶檢測新手段，成為CRISPR/Cas9及其衍生工具能否最終走上臨床的關鍵。

要擺脫脫靶位點預測，必須找到非常嚴格的對照組來確定基因突變位點，同時為檢測不依賴于sgRNA的隨機突變，最好使用基于單細胞的全基因組測序。研究者建立了一種名為“GOTI”的脫靶檢測技術，在小鼠受精卵分裂到二細胞期時，編輯一個卵裂球，并使用紅色熒光蛋白將其標記。小鼠胚胎發育到14.5天時，將整個胚胎消化為單細胞，通過紅色熒光蛋白，用流式細胞技術分選出基因編輯細胞和未基因編輯細胞進行全基因組測序，比較兩組差異。避免了單細胞體外擴增帶來的噪音問題，因實驗組和對照組來自同一枚受精卵，理論上基因背景完全一致，直接比對兩組細胞的基因組，其差異基本就可認為是基因編輯造成的。

借助GOTI檢測CRISPR/Cas9系統，發現設計良好的CRISPR/Cas9無明顯脫靶效應。而檢測其衍生技術——第三代單堿基編輯器（BE3），卻發現BE3有非常嚴重的脫靶，且大多發生在脫靶預測認為不太可能出現的位點。BE3可精確引入點突變，之前從未發現它有明顯脫靶問題。分析認為，這些脫靶位點有部分出現在抑癌基因上，BE3有很大隱患，不適用于臨床。這些發現證實以BE3為代表的部分基因編輯技術存在無法預測的脫靶風險，必須重新審視。該項研究建立了一種在精度、廣度和準確性上遠超之前的基因編輯脫靶檢測技術，有望開發精度更高、安全性更大的基因編輯工具，建立行業新標準。