熱回流法優化半楓荷總黃酮提取工藝

廖娜　梁秋玲　高幸玲　陳潔　黃初冬　韋啟球

摘??? 要： 運用熱回流提取法制備半楓荷總黃酮，通過單因素試驗及正交試驗考察總黃酮提取的最佳工藝.研究表明： 在熱回流提取法提取半楓荷總黃酮的最優提取工藝條件為：乙醇濃度80%、料液比1∶50（g/mL）、提取時間為2 h、提取溫度90 ℃，此條件下半楓荷總黃酮提取率為6.08%，RSD值為4.79%，表明該優化工藝穩定、可行、提取率高.

關鍵詞：總黃酮;半楓荷;熱回流法;正交試驗

中圖分類號：R284.2??????????????? DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2019.02.014

0??? 引言

半楓荷（Semiliquidambar cathayesis）是一種藥用植物，具有舒筋活血、抗炎、祛風除濕等多種功效.半楓荷的根、莖、葉均可入藥，由于其在民間用藥療效顯著，生物活性和化學成分受到廣大研究者的關注.據研究顯示，半楓荷根中含有多酚、有機酸類、甾醇、維生素、酰胺[1]、三萜和鞣花酸衍生物等物質[2-3].在生物活性方面，半楓荷枝干多酚具有抗菌、抗氧化活性[4]，半楓荷根提取物具有鎮痛、抗炎[5]、活血化瘀作用[6].

黃酮類化合物基本結構是二苯基丙烷（C6-C3-C6），是自然界的天然產物.由于具有抗菌[7]、抗病毒[8]、抗氧化、抗炎[9]、抗癌[10]等能力，是中草藥的主要活性成分.目前，有關半楓荷的報導，主要集中在半楓荷根的提取物的生物活性和單體化學成分研究，而對其枝干及總黃酮成分關注甚少.本文以半楓荷枝干為原料，運用熱回流提取法制備半楓荷總黃酮，通過單因素試驗及正交試驗考察總黃酮提取的最佳工藝.

1??? 材料與方法

1.1?? 材料、試劑與儀器

半楓荷枝干采自廣西武宣，由戴月副教授和韋運東副教授鑒定;蘆丁標準品（純度： 98%），百靈威科技有限公司;T6新世紀紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司;FA2004分析天平，上海舜宇平恒科學儀器有限公司;TDL-5000BR離心機，上海科學安亭儀器廠;其他試劑均為市售分析純.

1.2?? 方法

1.2.1?? 標準曲線

參考文獻[11-12]標曲的制作方法，稍加修改制作標準曲線.精密稱量蘆丁標準品10 mg，配制成????? 0.2 mg/mL的標準液.量取配制好的蘆丁標準液1.25 mL、2.5 mL、3.75 mL、5.0 mL、6.25 mL、7.5 mL于25 mL的容量瓶中，分別加入0.7 mL 5% NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min后加入0.7 mL 10% Al（NO3）3溶液，6 min后加入10 mL 1 mol/L的NaOH溶液，定容至刻度，搖勻.15 min后于509 nm處測吸光度A.以吸光度A值為縱坐標，濃度（mg/mL）為橫坐標作圖.

1.2.2?? 半楓荷預處理

將粉碎好的半楓荷粉末用石油醚脫脂直至石油醚變為無色[13]，除去葉綠素等雜質，晾干.

1.2.3?? 半楓荷總黃酮的提取

稱量約0.500 g的半楓荷粉末，加入乙醇溶液，在一定的條件下加熱回流提取[14].提取完后晾至室溫后，置于50 mL的離心管中，以4 000 r/min的轉速離心15 min.吸取上清液至50 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，搖勻，即為半楓荷總黃酮的提取液.

1.2.4?? 金縷半楓荷總黃酮含量測定

精密移取半楓荷總黃酮的提取液1 mL，置于25 mL的容量瓶中，依次加入同上的5% NaNO2、10%??? Al（NO3）3、1 mol/L NaOH，定容至刻度，搖勻.15 min后，于509 nm處測量吸光度A.提取率的計算公式如下：

[金縷半楓荷總黃酮提取率（%）=濃度×稀釋體積×提取液體積×100取樣體積×樣品質量]

1.2.5?? 單因素分析

分別考察提取時間C（30 min、60 min、90 min、120 min、150 min），乙醇濃度A（50%、60%、70%、80%、90%），提取溫度D（60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃），料液比B（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）等因素對半楓荷總黃酮提取率的影響.

1.2.6?? 正交試驗分析

單因素試驗結果表明，乙醇濃度、料液比、提取時間和提取溫度對總黃酮提取率均有影響，因而采用上述4個因素為考察對象，以半楓荷總黃酮提取率為評價指標，設計正交試驗L9（34），重復試驗3次.正交試驗因素水平表設計見表1.

1.2.7?? 數據處理

采用Excel 2010處理數據.

2???? 結果與討論

2.1??? 標準曲線

以吸光度（y）對質量濃度（x）進行線性回歸分析，得標準曲線回歸方程為： y=10.829x+0.003 7， R2=0.999 7.試驗結果見圖1，結果表明，蘆丁在0.005～0.060 mg/mL質量濃度區間與吸光度值具有很好的相關性.

2.2?? 單因素試驗結果

2.2.1??? 提取時間對總黃酮提取率的影響

試驗結果見圖2，據圖2可以看出，半楓荷總黃酮提取率在提取時間0.5～1.5 h時呈上升趨勢，當提取時間為1.5 h時，半楓荷總黃酮的提取率最大，有可能是半楓荷樣品粉末與提取溶劑接觸更為充分，提取率逐漸增加.而后，隨著提取時間延長，提取率降低，可能是雜質溶出量增多，而提取率呈現下降趨勢，導致金縷半楓荷總黃酮溶解的量變少.

2.2.2??? 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響

圖3表明，半楓荷總黃酮熱回流提取率受乙醇濃度的影響很明顯.當乙醇濃度逐漸增大時，半楓荷總黃酮提取率先是逐漸增高，而后降低.當乙醇濃度達到80%時，提取率達到最大值，可能是半楓荷總黃酮中水溶性黃酮的含量低于醇溶性黃酮的含量，導致當乙醇濃度到達80%后提取率反而呈下降趨勢.

2.2.3??? 溫度對總黃酮提取率的影響

隨著提取溫度的增加，半楓荷總黃酮提取率不斷增加（圖4），可能是溫度的升高有利于黃酮類物質的溶出，當溫度為80 ℃時達到最大值.但隨著溫度的升高，提取率略微下降，可能是因為溫度過高，導致黃酮類化合物的結構被破壞或發生氧化.

2.2.4??? 料液比對總黃酮提取率的影響

隨著料液比的增加，提取率在逐漸增加（圖5），可能是溶劑的增加加快與半楓荷粉末的充分接觸，使黃酮類化合物更快的溶出.當料液比為1∶40（g/mL）時，提取率不再增加.

2.3?? 正交試驗結果與分析

以半楓荷總黃酮提取率為研究對象，運用正交試驗原理考察、分析，試驗結果見表2.極差分析結果顯示，各因素對總黃酮提取率的影響大小依次為B>D>A>C，即料液比>提取溫度>乙醇濃度>回流時間.因此，根據試驗的結果，選擇A2B3C3D3為最佳提取條件，即乙醇濃度80 %、料液比1∶50（g/mL）、提取時間為2 h、提取溫度90 ℃.

2.4??? 驗證試驗

在乙醇濃度80 %、料液比1∶50（g/mL）、提取時間為2 h、提取溫度90 ℃的試驗條件下開展試驗.試驗結果表明（表3），正交試驗確定的半楓荷總黃酮最佳提取工藝穩定、可行，半楓荷總黃酮含量高于多酚含量[4，15].

表2? 正交試驗表及試驗結果

Tab.2? Orthogonal array design arrangement and experimental results

[實驗號?A /%?B /（g·mL-1）?C /h?D/°C ?總黃酮提取率/%?1?70?1∶30?1.0?70?5.72 ?2?70?1∶40?1.5?80?5.37 ?3?70?1∶50?2.0?90?6.39 ?4?80?1∶30?1.5?90?6.08 ?5?80?1∶40?2.0?70?5.77 ?6?80?1∶50?1.0?80?6.11 ?7?90?1∶30?2.0?80?5.82 ?8?90?1∶40?1.0?90?5.59 ?9?90?1∶50?1.5?70?5.48 ?K1?17.48?17.62?17.42?16.97?-?K2?17.96?16.73?16.93?17.30?K3?16.89?17.98?17.98?18.06?R?? 1.07?? 1.25?? 1.05?? 1.09?]

3??? 結論

本文以乙醇濃度、料液比、時間、溫度4個因素，應用熱回流法進行單因素試驗及正交試驗，得到最佳提取條件：即乙醇濃度80%、料液比1∶50（g/mL）、提取時間為2 h、提取溫度90 ℃.在該條件下，金縷半楓荷總黃酮提取率為6.08%，RSD值為4.79%，半楓荷總黃酮含量較高，可能是半楓荷的藥用成分.本研究所優化的提取工藝穩定、可行、提取率高，可為半楓荷總黃酮的開發利用提供理論基礎.

參考文獻

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Optimization of total flavonoids extraction from Semiliquidambar

Cathayesis by refluxing method

LIAO Na， LIANG Qiuling， GAO Xingling， CHEN Jie， HUANG Chudong， WEI Qiqiu*

（Health Science Center， Guangxi University of Science and Technology， Liuzhou 545005， China）

Abstract： To optimize the total flavonoids extraction from Semiliquidambar Cathayesis， the total flavonoids of Semiliquidambar Cathayesis was extracted wih refluxing method using single factor and orthogonal test. The results showed with the optimum extraction technology of the reflux extraction method， under the condition of ethanol concentration 80%， material to liquid ratio 1∶50 （g/mL）， extraction time 2 h， and extraction temperature at 90 °C， the extraction rate of total flavonoids was 6.08%， and the RSD was 4.79%. Therefore， the optimum?extraction process was stable， feasible and?efficient.

Key words： total flavonoids; Semiliquidambar Cathayesis; fefluxing method; orthogonal test