草莓KEA家族基因的克隆、鑒定及表達分析

姜玉素　李珍　王慶蓮　趙密珍　宋志忠

摘要：K+/H+逆向轉(zhuǎn)運體（KEA）介導(dǎo)細胞中K+和H+的動態(tài)平衡，在維持植物體內(nèi)的離子平衡、生長發(fā)育和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用，然而，相關(guān)研究主要體現(xiàn)在模式作物擬南芥中，果樹中KEA家族基因的功能依然未知。本研究以Yellow Wonder 5AF8草莓為材料，篩選并克隆KEA家族基因，并對其進行生物信息學(xué)鑒定和表達特征分析，為研究果樹K+/H+平衡及鉀素動態(tài)平衡機制提供基因資源和理論依據(jù)。結(jié)果表明，在草莓基因組中檢索并克隆到5個KEA家族基因，命名為FreKEAI～FreKEA5，屬于典型的植物K+/H+逆向轉(zhuǎn)運體基因;編碼的蛋白質(zhì)與7種已報道的不同科屬植物的KEA家族蛋白在氨基酸水平上具有25.00%的一致性，并可分為2個亞族（Group I和Group II），其中，草莓FveKEA1和FveKEA2屬于Group I，只含有4個Motif基序，而FveKEA3～FveKEA5屬于Group II，含有7個Motif基序;系統(tǒng)進化樹表明草莓FveKEA2和FveKEA4分別與葡萄VvKEA2和蘋果MdoKEA6緊密聚在一起，草莓FveKEA1、FveKEA3和FveKEA5分別與葡萄VvKEA1、白楊PtrKEA4、桃PpeKEA4等相應(yīng)成員在遺傳距離上較近;草莓KEA家族蛋白主要定位于細胞質(zhì)膜，均含有12～14個跨膜區(qū)，除FveKEA3外，均為穩(wěn)定蛋白，且只有FveKEA5含有信號肽;轉(zhuǎn)錄表達譜分析結(jié)果揭示草莓KEA家族基因在多種組織或器官中均有表達，實時熒光定量PCR結(jié)果表明FreKEAI在5AF8草莓不同組織中的整體表達水平最高，在花瓣和未成熟果實中的表達量最為突出，其次是FveKEA4，而其他3個基因的整體表達水平相對較低。此外，在草莓KEA基因啟動子區(qū)域鑒定到至少16種順式作用元件，且均含有光感應(yīng)、胚乳表達和脫落酸（ABA）響應(yīng)的作用元件。

關(guān)鍵詞：草莓;K+/H+逆向轉(zhuǎn)運體;生物信息學(xué)分析;基因克隆與表達

中圖分類號：S668.4

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-4440（2019）02-0391-09

鉀離子（K+）是細胞中含量最為豐富的金屬陽離子之一，控制著細胞基礎(chǔ)膜電位，調(diào)節(jié)細胞滲透平衡，在植物光合作用、蒸騰作用、氣孔開關(guān)和信號傳導(dǎo)等多種生命活動中起關(guān)鍵作用[1-2]。園藝研究中，鉀素營養(yǎng)與果樹生長發(fā)育、花開放、果實品質(zhì)和產(chǎn)量等密切相關(guān)[3-7]，但果樹鉀素營養(yǎng)高效利用的分子基礎(chǔ)研究較少。

CPAs（Cation proton antiporters）定位于細胞質(zhì)膜液泡膜和線粒體、葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器膜，是一類廣泛存在于植物、動物、真菌和細菌的陽離子_質(zhì)子逆向轉(zhuǎn)運體，可將細胞中的K+、Na+、Li+等陽離子排出，并引起細胞內(nèi)H+的內(nèi)流和積累[8-9]，維持細胞K+和H+的動態(tài)平衡。植物中，CPAs介導(dǎo)細胞中離子和pH的穩(wěn)態(tài)，在維持植物體內(nèi)的滲透平衡、生長發(fā)育和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用[8-16]。植物CPAs被分為2個亞族：CPA1和CPA2，其中，CPA1亞族主要是NHX（Na+/H+ exchanger）轉(zhuǎn)運體，CPA2亞族包括KEA（K+ efflux antiporter，K+/H+逆向轉(zhuǎn)運體）和CHX（Cation/H+ exchanger）轉(zhuǎn)運體[8-10]。近20年，NHX和CHX的研究報道相對較多，有關(guān)KEA亞族的研究最為稀少，主要體現(xiàn)在模式作物擬南芥中，Maser等在2011年最早揭示擬南芥中有6個At-KEA轉(zhuǎn)運體基因[11]，但所有AtKEA基因的功能至今依然沒有完全被解析。最近研究結(jié)果表明：擬南芥AtKEA轉(zhuǎn)運體定位于維管組織、保衛(wèi)細胞和花萼等不同組織部位[12]，擬南芥AtKEA1-3轉(zhuǎn)運體在光合作用、pH調(diào)控及葉綠體滲透調(diào)節(jié)等方面起關(guān)鍵作用，并在轉(zhuǎn)錄水平受外界滲透脅迫、鹽脅迫和ABA脅迫的調(diào)控[13-16]。

果樹中KEA家族基因的功能依然未知，僅見于梨KEA家族基因的克隆及生物信息學(xué)分析[17]。草莓[Fragaria resca]是一種全球重要的水果，隨著基因組序列的公布，迅速成為最具研究潛力的園藝作物之一[18]。本研究從草莓中克隆并鑒定了5個KEA家族基因，并通過實時熒光定量PCR分析組織特異性表達特征，為研究果樹鉀素營養(yǎng)與離子動態(tài)平衡提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及取樣

供試材料為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草莓資源圃中的草莓Yellow Wonder 5AF8，于2018年3月采樣。所取樣品依次為盛花期草莓植株的根、葉片、花瓣、花藥和草莓發(fā)育不同時期的果實（參照Fait等[19]描述，即：小綠果、白果轉(zhuǎn)色果、成熟果）。

1.2 草莓KEA基因克隆

以6個擬南芥KEA家族基因（TAIR數(shù)據(jù)庫，http：//www.arabidopsis.org/browse/'genefamily/index.jsp）編碼的氨基酸序列為參考，在Phytozome strawberry genome database（http：//www.phytozome.net）中檢索草莓基因組中可能的KEA家族基因。檢索結(jié)果在Pfam（http：//pfam.xfam.org/search）在線服務(wù)器預(yù)測功能結(jié)構(gòu)域。根據(jù)Phytozome獲得的草莓KEA基因CDS序列（coding sequence），分別設(shè)計引物，利用Prime STARTM HS DNA聚合酶（TaKaRa，大連）進行PCR擴增，測序驗證后，用于特異性表達引物設(shè)計。

1.3 草莓KEA家族基因生物信息學(xué)分析

在草莓基因組數(shù)據(jù)庫中獲得KEA家族各基因的CDS編碼區(qū)序列及基因組DNA序列，然后通過Gene structure display（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）在線服務(wù)器進行基因結(jié)構(gòu)分析，利用在線軟件TMpredict（http：//ch.embnet.org/sofware/TMPRED_form.html）分析草莓KEA家族蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，使用在線服務(wù)器MEME（v4.8.1）（http：//meme-suite.org/tools/meme）預(yù)測草莓KEA家族蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，使用在線工具ProtParam（http：//expasy.org/tools/protparam.html）評估KEA蛋白成員的理論等電點、分子量、穩(wěn)定性等理化性質(zhì)，利用在線軟件SignalP4.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/）預(yù)測KEA家族蛋白的信號肽情況，利用PSORT在線服務(wù)器（http：//psort.hgc.jp/form.html）預(yù)測草莓KEA家族蛋白的亞細胞定位，利用Phyre2在線服務(wù)器（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）分析草莓KEA家族蛋白的三級結(jié)構(gòu)，利用ClustalX 2.0軟件對5個草莓KEA轉(zhuǎn)運體與梨（12個）、蘋果（7個）、桃（5個）、葡萄（4個）、橙（5個）、楊樹（4個）等已知物種的同源KEA轉(zhuǎn)運體進行氨基酸序列比對分析[16]，用分子進化遺傳分析軟件MEGA7.0中的鄰接法（Neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。利用Kang等建立的草莓不同發(fā)育階段的表達譜數(shù)據(jù)庫Strawber-ry Genomic Resources（http：//bioinformatics.towson.edu/strawberry/）[18]獲得草莓KEA家族基因在不同組織的表達譜信息。為分析草莓KEA家族基因的啟動子區(qū)域，在Phytozome草莓基因組數(shù)據(jù)庫檢索目的基因CDS區(qū)域起始密碼子ATG的上游1.5kb左右片段的啟動子區(qū)域，并通過PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/ht-ml/）在線網(wǎng)站分析草莓KEA啟動子序列中是否含有的cis-順式作用元件。

1.4 實時熒光定量PCR分析

分別采集草莓5AF8不同部位的組織材料，液氮冷凍后-80C冰箱保存，通過MiniBESTPlantRNA Extraction Kit（TaKaRa，大連）提取樣品的總RNA，并利用PrimeScriptTM RT reagent Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，大連）合成第一鏈cDNA作為模板，用于實時熒光定量PCR。利用NCBI/Primer-BLAST在線服務(wù)器，設(shè)計草莓KEA基因的特異性表達引物（表1），以草莓Ubiquitin（GenBank No.MH114011）為目的基因，通過ABI 7500實時熒光定量PCR儀檢測KEA基因在草莓植株不同組織的表達特征。熒光染料使用SY BR Green（TaKa-Ra，大連），反應(yīng)體系參照說明書，反應(yīng)程序為：95C預(yù)變性30s;95°C變性5s，609C退火34s（40個循環(huán)）;最后72 C延伸10s。每個樣品進行3次重復(fù)，不同樣品在實時熒光定量PCR儀獲得相應(yīng)的Ct值，經(jīng)內(nèi)參基因Actin 均一化處理后，采用2-△OC’法計算基因的相對表達量[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓KEA家族基因的篩選與克隆

以6個擬南芥KEA家族基因的氨基酸序列為參考，在Phytozome strawberry genome database（http：//www.phytozome.net）草莓基因組數(shù)據(jù)庫中檢索到5個KEA家族基因，檢索結(jié)果在Pfam在線服務(wù)器預(yù)測到K/H交換結(jié)構(gòu)域（K/H exchanger domain）（PF00999）和TrkA-N domain（PF02254）功能結(jié)構(gòu)域，均屬于典型的KEA家族蛋白。檢索獲得各基因的堿基序列后，以CDS序列起始密碼子ATG和終止密碼子TAG所在位置20 bp左右的序列作為上下游引物，以5AF8草莓幼葉RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，PCR擴增各個候選基因的CDS序列，分別連接到pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)菌株DH5a，篩選陽性轉(zhuǎn)化子送北京擎科生物技術(shù)有限公司測序。經(jīng)測序驗證后，獲得草莓5AF8的KEA家族各基因的CDS序列及相應(yīng)翻譯得到的氨基酸序列，獲得的草莓KEA家族基因分別命名為FveKEAI～FveKEA5。

2.2 7種不同科屬植物KEA家族成員的系統(tǒng)發(fā)育樹

將草莓（薔薇科）、桃（薔薇科）、梨（薔薇科）、蘋果（薔薇科）、葡萄（葡萄科）、橙（蕓香科）、白楊（楊柳科）等7種不同科屬物種的KEA家族基因（表2），通過ClustalX 2.0進行氨基酸水平的多重序列比對。結(jié)果表明，供試物種的KEA家族基因之間具有較高的同源性，同源關(guān)系較近的兩者之間的序列一致性均高于66.05%;7種植物42個KEA家族成員在氨基酸水平依然具有25.00%的一致性，在核苷酸水平具有25.60%的一致性;5個草莓KEA家族成員在氨基酸水平具有41.88%的一致性（圖1），在核苷酸水平具有40.97%的一致性。利用MEGA 7.0建立系統(tǒng)進化樹，結(jié)果表明，7種植物KEA家族成員可分為2個亞族，Group I和Group II，其中，草莓FveKEAI和FveKEA2屬于Group I，而FveKEA3、FreKEA4和FveKEA5屬于Group II（圖1和表3）。此外，7種植物KEA家族基因在遺傳進化關(guān)系上有差異，草莓和薔薇科植物（蘋果和桃）、葡萄科葡萄、楊柳科白楊在遺傳距離上是較近的，其中，草莓FveKEA2和FreKEA4分別與葡萄VoKEA2和蘋果MdoKEA6緊密聚在一起，草莓FreKEAI、FveKEA3和FveKEA5分別與葡萄VvKEAI、白楊PtrKEA4桃Ppe-KEA4等相應(yīng)成員在遺傳距離上較近（圖1）。身為蕓香科植物，橙KEA成員則聚集在一起，與白楊PtrKEAI和PtrKEA2在遺傳距離上較近，且均屬于Group I亞族（圖1）。

2.3 草莓KEA基因及編碼蛋白質(zhì)特征分析

草莓KEA家族基因主要定位于1號（FveKEA5）、2號（FveKEA2和FrveKEA3）和7號（FveKEAI和FveKEA4）染色體上，含有至少27個長度不一的內(nèi)含子，其中FreKEA3基因擁有最多（34個）的內(nèi)含子數(shù)目（表3）;FreKEAI基因CDS編碼區(qū)最長，其次是FveKEA3，F(xiàn)veKEA5最短，其編碼氨基酸數(shù)目和分子量與CDS長度成正比（表2）;保守基序分析結(jié)果表明草莓FveKEA1含有4個Motif基序（Motif4 ～Motif7），F(xiàn)veKEA2蛋白含有4個Motif基序（Motif2、Motif4、Motif6和Motif7），而FveKEA3、FveKEA4和FveKEA5均含有7個Motif基序，即Motif1～Motif7（圖2和表3）。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析結(jié)果表明草莓FveKEA1、FveKEA2和FveKEA5擁有相似的三級結(jié)構(gòu)，暗示這3個蛋白質(zhì)可能擁有相近的功能，而FveKEA3和FveKEA4則分別擁有獨特而差異明顯的三級結(jié)構(gòu)（圖2）。

此外，F(xiàn)veKEA4的等電點（PI）>7.00，其他草莓KEA家族蛋白的等電點均小于7.00，表明FveKEA4含有的堿性氨基酸較多，而其他4個成員的酸性氨基酸較多;草莓KEA家族蛋白均含有12～14個跨膜區(qū)，且只有FveKEA5具有信號肽，位于第22～23氨基酸區(qū)域;此外，F(xiàn)veKEA3蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)>40，為不穩(wěn)定蛋白，而其他4個成員均小于40，為穩(wěn)定蛋白（表3）。

2.4 草莓KEA基因啟動子順式作用元件分析

cis-順式作用元件預(yù)測結(jié)果表明，草莓KEA家族基因啟動子區(qū)域鑒定到至少16種順式作用元件，包括營養(yǎng)和發(fā)育、激素響應(yīng)、脅迫響應(yīng)、晝夜規(guī)律等不同生命過程的調(diào)控元件（表4）。其中，3種（光感應(yīng)、胚乳表達和脫落酸ABA響應(yīng)）轉(zhuǎn)錄元件在全部5個FreKEA基因的啟動子中均能預(yù)測到，茉莉酮酸甲酯（除FveKEA2基因）和赤霉素（除FveKEA5基因）響應(yīng)作用元件在4個基因的啟動子區(qū)域能檢測到，水楊酸響應(yīng)、熱脅迫、厭氧感應(yīng)、干旱誘導(dǎo)、低溫感應(yīng)和生長素響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件均在不同的3個FrveKEA基因的啟動子區(qū)域出現(xiàn)，防御與脅迫、晝夜規(guī)律和真菌激發(fā)子響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件均能在不同的2個FveKEA基因的啟動子區(qū)域出現(xiàn)，此外，玉米蛋白代謝（FveKEA2）和乙烯響應(yīng)（FveKEA3）相關(guān)的順式作用元件分別在一個FreKEA基因的啟動子區(qū)域鑒定到（表4）。

2.5 草莓KEA蛋白亞細胞定位預(yù)測及KEA基因表達譜分析

亞細胞定位預(yù)測結(jié)果表明草莓FveKEA蛋白主要定位于細胞質(zhì)膜，其次是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜（FveKEA2除外）和液泡膜（FveKEA2和FveKEA5 除外），F(xiàn)veKEA2在葉綠體和線粒體等細胞器的膜上也有檢測到，F(xiàn)veKEA3也定位于核膜上（表5）。

草莓表達譜數(shù)據(jù)庫Strawberry genomic resources檢索結(jié)果表明，草莓FveKEA基因在心皮、花藥、果皮、胚、去胚種子、胚珠、子房、花粉、幼苗、花柱、種皮、花粉粒、花瓣、花被和花托等多種組織中均能檢測到（圖3）;FveKEAI和FveKEA4的表達量相對較高，其中，F(xiàn)veKEAI主要在花粉粒、花瓣、花被和花托中表達，其次是花藥和幼苗，F(xiàn)veKEA2主要在幼苗中表達，在花粉中表達量極低，F(xiàn)veKEA3主要在子房中表達，F(xiàn)reKEA4主要在花柱、種皮和花藥中表達，F(xiàn)veKEA5表達量較低，在種皮、花粉和胚中均少量表達（圖3）。

2.6 草莓KEA家族基因組織特異性表達分析

熒光定量PCR分析結(jié)果表明：FveKEAI～FveKEA5在草莓5AF8不同組織中的表達量有差異，F(xiàn)veKEAI在不同組織中的整體表達水平最高（特別是花瓣中），其次是FveKEA4，其他3個基因在草莓不同組織中的表達水平較為接近，均顯著低于FveKEAI和FveKEA4，與表達譜分析結(jié)果基本一致（圖4）;在不同組織中，F(xiàn)veKEAI在花瓣和未成熟果實（包括綠果期、白果期和轉(zhuǎn)色期）中的表達量最高，其次是花藥，花柱中最低;FveKEA2在葉片的表達量最高，其次是根部，在花柱和花藥中的表達量最低;FveKEA3在不同組織中的表達量沒有顯著差異;FveKEA4在花柱和花藥等花器官中的表達水平最高，顯著高于其他組織;FveKEA5在花柱、花藥和未成熟果實（綠果期、白果期及轉(zhuǎn)色期）中的表達水平較高，顯著高于其他組織（圖4）。

3 討論

植物鉀素營養(yǎng)研究中，KEA轉(zhuǎn)運蛋白是一類維持體內(nèi)K+/H+動態(tài)平衡并參與滲透調(diào)節(jié)和pH穩(wěn)定的逆向轉(zhuǎn)運體。有關(guān)K+吸收、轉(zhuǎn)運、卸載和分配的研究較為詳盡[21]，而對同時轉(zhuǎn)運K+和H+的KEA轉(zhuǎn)運體的研究較少。然而，相關(guān)報道主要集中在模式作物擬南芥，果樹作物KEA轉(zhuǎn)運體的具體功能依然未知。

基因組測序技術(shù)的迅速發(fā)展，為果樹作物的科學(xué)研究提供了基因資源。本研究從薔薇科植物中克隆并鑒定了5個FveKEA轉(zhuǎn)運體基因，與薔薇科桃和蕓香科橙中KEA基因成員數(shù)目一致，與葡萄科葡萄和楊柳科白楊接近，而遠低于同屬薔薇科果樹的梨和蘋果，表明，同一家族基因成員的數(shù)目在同一科屬的不同作物之間差異較大，而在相同科屬的不同作物之間可能相同或相近，暗示基因功能的多樣性或差異性。此外，不同物種KEA家族成員在遺傳進化關(guān)系上存在差異，草莓和同屬薔薇科植物（蘋果和桃）在遺傳距離上較近，而蕓香科植物橙KEA成員則集中聚集在-起，與薔薇科和葡萄科果樹作物KEA進化關(guān)系較遠。在5個草莓KEA轉(zhuǎn)運體中，F(xiàn)veKEA1和FveKEA2同屬于Group I，且具有相似的Motif和高級蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，暗示進化關(guān)系上相近的（同一亞族）且具有類似蛋白質(zhì)Motif基序的2個轉(zhuǎn)運體之間可能具有相似的功能，而FveKEA3、FveKEA4和FveKEA5同屬于GroupII，且具有7個相同的Motif，但在高級蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上差異很大，暗示遺傳關(guān)系相近的成員可能在長期進化過程中發(fā)生了不同功能的演變。

Kunz等報道擬南芥AtKEA1～AtKEA3主要定位于細胞質(zhì)膜_上[13-14，16]，本研究中亞細胞定位預(yù)測結(jié)果表明草莓FveKEA1～FveKEA5主要分布在細胞質(zhì)膜上，與Kunz等報道相一致。Han等[12]報道指出擬南芥AtKEAI和AtKEA3主要在地上部表達，而其他4個成員基因在植物全身均有表達;Chen等[2]報道GmKEA家族基因在大豆不同組織中均有表達，且差異顯著。本研究熒光定量PCR結(jié)果表明草莓KEA家族基因在試驗草莓根部、葉片、花器官和不同發(fā)育期果實等多種組織中均有表達，且與轉(zhuǎn)錄表達譜分析結(jié)果相一致。Zhou等[18]報道梨KEA家族基因在花粉形成不同時期的表達量極低，但沒有研究其在其他組織中的表達特征，與之相應(yīng)的是，草莓KEA家族基因在盛開期花粉中的表達量相對較低，與之不同的是，草莓KEA家族基因在花藥中均有表達，F(xiàn)veKEAI和FveKEA4較為顯著。特別是，F(xiàn)veKEAI在草莓不同檢測組織中的整體表達水平最高，在花瓣和未成熟果實中尤為突出，推測FveKEAI可能是在花開放和草莓幼果發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用的K+/H+逆向轉(zhuǎn)運體。果實成熟是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，伴隨各種代謝產(chǎn)物的積累和轉(zhuǎn)化，而在成熟期草莓果實中，除FrveKEA4外，其他4個基因的表達水平顯著下降，推測這些基因編碼的KEA逆向轉(zhuǎn)運體的功能在果實成熟時期發(fā)揮的較少，所需的K+較少，有可能將胞內(nèi)的K+外排或者向其他組織（如韌皮部或葉片）轉(zhuǎn)移，這與同為鉀離子轉(zhuǎn)運體的KT/HAK/KU家族轉(zhuǎn)運體類似[23]。

此外，在草莓FveKEAI～FveKEA5啟動子區(qū)域鑒定到多種順式作用元件，且均含有光感應(yīng)、胚乳特異表達和ABA響應(yīng)的作用元件，說明多種順式作用元件易與草莓KEA啟動區(qū)的關(guān)鍵元件相結(jié)合進而調(diào)控KEA家族基因的表達水平。特別地，擬南芥[17]和大豆21中KEA家族基因在轉(zhuǎn)錄水平易受ABA處理的調(diào)控，本研究中草莓KEA基因啟動子區(qū)域均含有ABA響應(yīng)的作用元件，暗示該家族基因有類似的滲透響應(yīng)和調(diào)節(jié)的作用，這為進一步研究草莓KEA轉(zhuǎn)運體的功能及其調(diào)控機理提供了理論支持。

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