不同凍結(jié)方式對中華絨螯蟹蟹肉品質(zhì)的影響

邵俊杰　朱昱璇　黃鴻兵　張世勇　潘建林　萬金娟　陳風蔚　尹思慧　張美琴　付龍龍　馬昊

摘要：為探究凍結(jié)方式對中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）蟹肉生化特性和感官品質(zhì)的影響，以鮮活中華絨螯蟹為原料，分別進行-20℃、-40℃、-70℃、液氮速凍處理，之后于20℃條件下儲藏180d，分析中華絨鰲蟹感官特性、pH值、失水率、丙二醛含量鹽溶性蛋白質(zhì)含量、總巰基含量和Ca2+-ATPase活性等指標的變化趨勢。結(jié)果表明，隨著凍藏時間的延長，中華絨螯蟹蟹肉的pH值降低，失水率增大，鹽溶性蛋白質(zhì)含量降低，丙二醛含量增大，總巰基含量降低，Ca2+-ATPase活性下降。中華絨螯蟹肌原纖維蛋白的變性程度與凍結(jié)方式密切相關(guān)。凍結(jié)溫度越低，凍藏期內(nèi)蟹肉各指標數(shù)值變化越小，蛋白質(zhì)完整度和感官接受度越高，與新鮮蟹肉品質(zhì)越接近。與-20℃、-40℃、-70℃速凍處理相比，液氮速凍能更好地減緩蟹肉蛋白質(zhì)變性和脂肪氧化，能最大限度地保持蟹肉感官品質(zhì)，是最佳的速凍工藝。

關(guān)鍵詞：中華絨螯蟹;凍結(jié)方式;感官品質(zhì);生化特性

中圖分類號：TS254.4

文獻標識碼：A

文章編號：1000-4440（2019）02-0429-07

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis），又稱河蟹、大閘蟹、螃蟹，是中國特有的、經(jīng)濟價值較高的名貴水產(chǎn)品。中華絨螯蟹因其肉質(zhì)細嫩，蛋白質(zhì)含量高，不飽和脂肪酸種類豐富，富含鈣、磷、鐵、鋅、銅、糖類、蟹黃素、蟹紅素等營養(yǎng)物質(zhì)[1-2]，深受消費者歡迎。近年來，中國中華絨螯蟹養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，現(xiàn)已成為特種水產(chǎn)品中最具影響力的產(chǎn)業(yè)之一。中華絨螯蟹是季節(jié)性非常強的水產(chǎn)品，上市時間集中，只有在每年固定的時間節(jié)點，中華絨螯蟹才能膏滿黃肥。因此，為防止市場上因中華絨螯蟹積壓而出現(xiàn)腐敗變質(zhì)問題，同時保證中華絨螯蟹能夠全年供應(yīng)，滿足出口需求，中華絨螯蟹的凍藏加工技術(shù)研究已迫在眉睫。

凍藏是現(xiàn)在最普遍和最有效的農(nóng)產(chǎn)品保藏方法，對水產(chǎn)品貯藏、運輸和加工意義重大[34]。冷凍處理能夠抑制微生物生長和內(nèi)源酶作用，延長產(chǎn)品貨架期，但也會造成蛋白質(zhì)變性和脂肪氧化，改變肌肉的結(jié)構(gòu)特性、保水性、風味等品質(zhì)特性，對產(chǎn)品銷售和食用產(chǎn)生負面影響[57]。有研究者發(fā)現(xiàn)，肌肉品質(zhì)變化與凍結(jié)方式有緊密聯(lián)系[4，8]。因此，研究凍結(jié)方式對中華絨螯蟹蟹肉生化特性的影響、篩選最佳凍藏工藝對蟹肉品質(zhì)提升十分必要。

目前，低溫凍結(jié)技術(shù)針對的水產(chǎn)品主要是海水魚[9-10]、蝦等，關(guān)于中華絨螯蟹凍藏工藝的報道較少。因此，本研究通過測定凍藏期內(nèi)中華絨螯蟹肌肉感官特性、pH值、失水率、丙二醛（Malondialde-hyde，MDA）含量、鹽溶性蛋白質(zhì)含量、總巰基含量、Ca2+-ATPase活性等指標，分析不同凍結(jié)方式對中華絨螯蟹蟹肉品質(zhì)的影響，為中華絨螯蟹原料加工利用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活雄性中華絨螯蟹由宿遷市成子湖食品有限公司提供，體質(zhì)量為（140+15）g，江蘇省淡水水產(chǎn)

研究所鑒定為中華絨螯蟹。

MDA測定試劑盒、Ca2+-ATP酶活性試劑盒購自南京建成生物工程研究所，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DW-225低溫試驗箱，南京泰斯特試驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品;C-MAG HS7數(shù)顯加熱磁力攪拌器、U1-tra Turrax T-25 Basic高速勻漿機，德國IKA公司產(chǎn)品;211 pH計，意大利Hanna公司產(chǎn)品;Kjeltec'M2300全自動凱氏定氮儀，瑞典FOSS公司產(chǎn)品;M2e酶標儀，美國MD公司產(chǎn)品;Beckman Avanti J-A和AR64離心機，美國Beckman Coulter公司產(chǎn)品;ZKSY-600水浴鍋，南京科爾儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 中華絨螯蟹凍結(jié)和貯藏

將鮮活中華絨螯蟹用水沖洗干凈并瀝干，然后進行如下凍結(jié)處理。①快速凍結(jié)：將中華絨螯蟹分別放入-20℃、-40℃、-70℃的低溫試驗箱中速凍，直至中華絨螯蟹腹部中心溫度達到-20℃，所用時間依次為185min、136 min和45 min;②液氮速凍：將中華絨螯蟹浸沒于液氮中直至中心溫度達到-209C，所用時間為90s。將凍結(jié)完成的中華絨螯蟹置于保鮮盒中密封，在-20℃下儲藏。

1.3.2 取樣

定期（0d、30d.90d、180d）取樣，將凍藏中華絨螯蟹置于4℃冰箱中解凍。解凍完成后，除去中華絨螯蟹中的不可食部分，取中華絨螯蟹腹部肌肉進行指標測定。

1.3.3 感官評價

由經(jīng)過訓練的10名感官評定員采用盲評計分方式分別從色澤、氣味、質(zhì)地3個方面對中華絨螯蟹進行評分，各指標的感官評價分值控制在0～9范圍內(nèi)，0分代表品質(zhì)最差，9分代表品質(zhì)最佳。每名感官評定員根據(jù)評定標準（表1）對中華絨螯蟹品質(zhì)進行評分，取其平均值作為最終評定結(jié)果。

1.3.4 pH 的測定

將5 g蟹肉與45 ml水混合，勻漿，10000g離心15 min，測定pH。

1.3.5 失水率的測定

參照楊利艷等[12]的方法，略有改動。將凍藏的中華絨螯蟹在4℃下解凍12 h，用濾紙拭去表面水分并瀝干，稱質(zhì)量。計算失水率，失水率=[（速凍前質(zhì)量-速凍后質(zhì)量）/速凍前質(zhì)量]x100%。

1.3.6 鹽溶性蛋白質(zhì)的提取和測定

參照陰曉菲等[13]的方法提取鹽溶性蛋白質(zhì)。鹽溶性蛋白質(zhì)含量的測定采用雙縮脲法。

1.3.7 MDA含量的測定

參照吳慶元等[14]的方法，略有改動。取一定量蟹肉，加入5倍體積去離子水，10000 r/min勻漿1 min，用于丙二醛含量的測定。用MDA測定試劑盒測定MDA含量。

1.3.8 Ca2+-ATPase活性的測定

使用超微量Ca2+-ATP酶活性試劑盒測定蟹肉Ca2+-ATPase活性。

1.3.9 總巰基（SH）含量的測定

參照彭歡歡等[15]和魯耀彬等[16]的方法。取方法1.3.6 中提取的1 ml肌原纖維蛋白質(zhì)（4 mg/ml），加入9.0 ml 0.2 mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液（含有8 mol/L脲，2%十二烷基硫酸鈉和10mmol/L乙二胺四乙酸，pH6.8）混合，取4 ml混合液，加入0.4 ml0.1% 5，5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB），40℃水浴25min，在412 nm波長處測吸光值，用0.6 mol/L KCl（pH 7.0）溶液作為空白對照。計算總SH含量，SH含量=[（AXn）/（cxM）]x106，式中，A為412 nm處的吸光值，n為稀釋倍數(shù)，c為摩爾吸光系數(shù)[其值為13600mol/（L.em）]，M為肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度（mg/ml）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用SAS（Statistics analysis system，Version 8.12）軟件進行統(tǒng)計分析，方差分析采用ANOVA（Analy-sis of variance）分析，多重比較采用Duncan multiple-arrage test，差異顯著性為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 凍結(jié)方式對中華絨螯蟹肌肉感官品質(zhì)的影響

各冷凍處理的中華絨鰲蟹蟹肉感官指標評分均低于新鮮對照（表2），說明經(jīng)過冷凍處理后，蟹肉的感官品質(zhì)均下降。不同凍結(jié)方式對中華絨螯蟹肌肉的色澤、質(zhì)地有顯著影響（P<0.05），但對氣味的影響較小;凍結(jié)溫度越高，凍藏時間越長，肌肉色澤變化越明顯，質(zhì)地尤其是彈性越差。在相同儲藏時間內(nèi)，液氮速凍處理的蟹肉各項感官評分較高，與新鮮對照較為接近，其次是-70°C處理、-40℃處理和-20℃處理。以上結(jié)果說明，相同儲藏條件下，凍結(jié)方式對蟹肉感官特性有顯著影響。

2.2 凍結(jié)方式對中華絨螯蟹pH的影響

中華絨螯蟹適合生長在pH7～9的水環(huán)境中，本試驗所用中華絨螯蟹的pH值為8.13左右。在凍藏過程中，各處理的pH值均呈下降趨勢（圖1）。-20℃和-40℃處理的pH值在凍藏初期下降明顯，90d后pH值開始上升，并且-20℃處理的，上升速度高于-40℃處理。液氮處理的pH值變化最為平緩，其次是-70℃處理，180d后pH值分別為7.58和7.46，兩處理在儲藏90d后都沒有出現(xiàn)明顯的pH值上升的現(xiàn)象。

2.3 凍結(jié)方式對中華絨螯蟹失水率的影響

在凍結(jié)過程中，中華絨螯蟹內(nèi)部形成大量的冰晶，細胞膜滲透壓改變，細胞結(jié)構(gòu)和組織破裂，解凍后冰晶融化，自由水和一部分結(jié)合水流失，最終導致汁液和營養(yǎng)物質(zhì)流失。不同凍結(jié)方式下中華絨螯蟹失水率隨著儲藏時間的延長呈明顯增加的趨勢，各處理間差異顯著（圖2）。-20℃、-40℃、-70℃和液氮處理在儲藏180d后，失水率由最初的1.06%分別上升到3.26%、2.81%、2.24%和1.81%，分別增加了2.08倍、1.65倍、1.11倍和0.71倍。因此，凍結(jié)溫度越低，解凍后蟹肉失水率越低，持水力越高。

2.4 凍結(jié)方式對中華絨螯蟹脂肪氧化的影響

中華絨螯蟹蟹肉中不飽和脂肪酸含量占總脂肪含量的70%以上，油酸C18：1w9作為評價肉品質(zhì)的重要指標之一，含量最高（22.39%～30.10%）[17]。由于蟹肉中不飽和脂肪酸含量高，因此在低溫條件下也會發(fā)生氧化，對產(chǎn)品品質(zhì)和貨架期產(chǎn)生負面影響[8]。中華絨螯蟹初始MDA含量很低，約為0.29mg/kg（圖3）。-20℃處理的MDA含量在貯藏前90d內(nèi)持續(xù)快速上升，在90d時達到峰值（0.55mg/kg），隨后緩慢降低。-40℃、-70℃和液氮處理的MDA含量變化較一致，在180d的貯藏期內(nèi)均是持續(xù)增大。液氮處理的MDA含量最低（0.45 mg/kg），較凍藏初期僅增加了55%。

2.5 凍結(jié)方式對中華絨螯蟹鹽溶性蛋白質(zhì)含量的影響

鹽溶性蛋白質(zhì)，即肌原纖維蛋白質(zhì)，是肌肉蛋白質(zhì)的主要組成部分，對蟹肉品質(zhì)起到關(guān)鍵作用。各處理的鹽溶性蛋白質(zhì)含量在前90d快速降低，隨后下降速度減慢（圖4）。速凍溫度越高，蟹肉鹽溶性蛋白質(zhì)含量下降越明顯。-20℃、-40℃、-70℃和液氮速凍處理在凍藏180d后，鹽溶性蛋白質(zhì)含量由最初的36.11 mg/g分別下降到14.03 mg/g.18.36 mg/g、22.69 mg/g、25.97 mg/g，分別下降了61.15%、49.16% 37.16%、28.08%。

2.6 凍結(jié)方式對中華絨螯蟹肌原纖維蛋白質(zhì)總巰基含量的影響

巰基是肌原纖維蛋白質(zhì)中活性最強的功能基團，在凍藏期間巰基易被氧化形成二硫鍵，導致巰基含量降低。凍藏前30d，各處理的總巰基含量下降速度較快，隨后下降速度減緩。凍藏180d后，-20℃、-40℃、-70℃、液氮速凍處理的總巰基含量分別降低到初始值的52.71%、60.24%、65.36%、69.58%，說明在相同凍藏條件下，凍結(jié)方式對巰基氧化程度有顯著影響，凍結(jié)溫度越低，總巰基含量越高（圖5）。

2.7 凍結(jié)方式對中華絨螯蟹Ca2+-ATPase活性的影響

各處理的Ca2+-ATPase活性在前90d降低明顯，隨后持續(xù)下降，但速度略有減慢（圖6）。-20℃處理的降幅最大，180d凍藏期結(jié)束時剩余Ca2+-AT-Pase活性[0.57 μumol/（mg·min）]僅為新鮮樣品的30.32%;其次是-40℃、-70°C處理，殘留Ca2+-AT-Pase活性分別為0.81 μmol/（mg·min）和1.00μmol/（mg·min）;液氮速凍處理的下降趨勢最為平緩，180d儲藏期結(jié)束時，殘留活性為1.18μmol（mg·min），為新鮮樣品的62.77%。因此，凍結(jié)溫度越低，Ca2+-ATPase活性越高。

3 討論

水產(chǎn)動物停止呼吸后，體內(nèi)糖原生成乳酸，導致肌肉pH值下降。但是，微生物代謝、蛋白質(zhì)及其他含氮物質(zhì)降解生成氨及胺類等堿性物質(zhì)，又使肌肉pH值升高[19]。因此，pH值是評價肌肉新鮮度的重要參考指標。凍藏初期，中華絨螯蟹體內(nèi)糖原生成乳酸，所有處理的pH值呈下降趨勢。凍藏90d后，-20℃和-40℃處理的中華絨螯蟹體內(nèi)出現(xiàn)微生物代謝活動，以及蛋白質(zhì)在內(nèi)源性組織蛋白酶作用下發(fā)生降解，生成堿性物質(zhì)，pH值升高。-70℃和液氮處理在凍藏后期沒有出現(xiàn)pH值明顯升高的現(xiàn)象，說明超低溫速凍能有效地抑制微生物生長，減緩蛋白質(zhì)降解。屠冰心等[20]在研究低溫冷凍對大黃魚凍藏品質(zhì)影響的過程中也發(fā)現(xiàn)，大黃魚肌肉在凍藏過程中pH值總體呈先下降后上升的趨勢。楊利艷等[12]認為液氮速凍的凡納濱對蝦pH值與新鮮的凡納濱對蝦最為接近，并且凍結(jié)溫度越高，pH值越低。

中華絨鰲蟹體內(nèi)液體流失主要是因為在凍結(jié)過程中冰晶的形成破壞了肌肉組織和細胞結(jié)構(gòu)，而冰晶的形成與凍結(jié)時間有顯著的相關(guān)性[15-16]。一般來說，0℃至-5℃的降溫過程為最大冰晶生成帶。在此期間，細胞外水分率先結(jié)晶，導致細胞外溶液離子濃度增大，造成細胞內(nèi)溶液外移，繼而形成更大的冰晶。冰晶擠壓細胞，使細胞破裂，肌肉組織結(jié)構(gòu)也被破壞，造成解凍后汁液流失增多。同時，蛋白質(zhì)分子失去結(jié)合水，發(fā)生凝集，導致變性，最終引起肌肉品質(zhì)下降[12]。因此，在凍結(jié)過程中，通過最大冰晶生成帶所需要的時間越短，水產(chǎn)品體內(nèi)形成的冰晶越小，對肌肉組織的破壞越小，產(chǎn)品品質(zhì)越高。本試驗中，與-20℃、-40℃和-70℃處理相比，液氮處理的溫度極低，可以在最短的時間內(nèi)通過最大冰晶生成帶，使中華絨螯蟹中心溫度在90s內(nèi)達到-20℃，細胞內(nèi)水分子來不及移動便形成了數(shù)量多且分布均勻的小冰晶，明顯減弱了對組織結(jié)構(gòu)的破壞，避免了大量蛋白質(zhì)變性和營養(yǎng)成分的流失。本研究結(jié)果與楊利艷等[12]和Goncalves等[21]的報道一致，液氮速凍能夠顯著減少水產(chǎn)品的失水率，更好地保持產(chǎn)品風味和營養(yǎng)。隨著凍藏時間的延長，4種凍結(jié)方式的失水率不斷增大，原因是在凍藏期間，冰晶體積增大，加大了對肌纖維結(jié)構(gòu)的破壞，更多的結(jié)合水轉(zhuǎn)化為自由水門。

MDA是脂質(zhì)過氧化作用的產(chǎn)物，其含量越高，說明脂肪氧化程度越高，酸敗就越嚴重。MDA也是一種致癌物質(zhì)[22-23]，所以MDA含量不僅能夠作為水產(chǎn)品中脂肪酸敗程度的評價指標，還能反映其食用安全性。在凍藏過程中，蟹肉中自由水含量減少，組織間隙液濃度增大，易導致脂肪氧化速度加快。本研究中，-20℃處理的MDA含量在90d時達到峰值，隨后緩慢降低，原因可能是氧化產(chǎn)物醛、酮進一步降解，與蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物發(fā)生相互作用。MDA能與魚肉中的氨基反應(yīng)生產(chǎn)1-氨基-3-氨基丙烯，導致MDA含量下降[24]。彭歡歡等[15]研究發(fā)現(xiàn)，-20C速凍蟹肉貯藏12周時MDA含量達到最大值，之后MDA含量降低。-40℃、-70℃和液氮處理的MDA含量平穩(wěn)上升，說明超低溫速凍處理能夠延緩蟹肉脂肪氧化，避免二級氧化產(chǎn)物的再次降解。

在中華絨螯蟹速凍過程中，蛋白質(zhì)的部分結(jié)合水形成冰晶，使蛋白質(zhì)分子間形成非共價鍵，進而形成不溶性大分子聚集體，導致蛋白質(zhì)溶解性下降[25]。另外，巰基氧化后形成的二硫鍵會導致肌球蛋白重鏈聚合，引起蛋白質(zhì)溶解性、營養(yǎng)品質(zhì)下降[15-26]。從本試驗結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，在不同凍結(jié)方式下，中華絨螯蟹鹽溶性蛋白質(zhì)含量的下降趨勢與總巰基含量的變化趨勢存在明顯相關(guān)性。說明中華絨螯蟹鹽溶性蛋白質(zhì)含量的下降在很大程度上是由巰基氧化形成二硫鍵所引起的。

蛋白質(zhì)巰基活性較高，且對氧化反應(yīng)比較敏感，因此巰基含量變化可以用于表征蛋白質(zhì)氧化的程度。由于冰晶的形成，導致肌動球蛋白分子間的引力增強，但蛋白質(zhì)分子與水分子的相互作用減弱，造成蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，使埋藏在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏基暴露出來，進而被氧化成二硫鍵，引起疏基含量降低[2]。因此，速凍方式對巰基含量變化的影響極其顯著。彭歡歡等[15]和陰曉菲等[13]分別研究了凍結(jié)方式對中華絨螯蟹和草魚生化特性的影響，發(fā)現(xiàn)-60℃、-40℃凍結(jié)樣品比-20℃凍結(jié)樣品具有更高的鹽溶性蛋白質(zhì)和巰基含量，表明凍結(jié)溫度越低，形成的冰晶越小，對肌原纖維蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞越小，這與本試驗結(jié)果一致。本研究中各處理的巰基含量在前30d下降較快，可能是因為蛋白質(zhì)分子外側(cè)有大量的巰基，而這部分巰基在肌原纖維蛋白質(zhì)不變性的情況下就能在儲藏初期率先發(fā)生氧化。

Ca2+-ATPase活性源于肌球蛋白頭部結(jié)構(gòu)，是反應(yīng)肌球蛋白完整性的重要參數(shù)[28]。凍藏期Ca2+-ATPase活性越高，則肌球蛋白的完整性越高，變性程度越低，肉品品質(zhì)越高[2930]。在超低溫凍結(jié)過程中，由于冰晶的形成伴隨著肌肉中鹽分濃縮，離子強度增加，致使肌球蛋白頭部構(gòu)象發(fā)生變化，進而使Ca2+-ATPase活性降低[31]。蛋白質(zhì)分子間相互作用的增強導致蛋白質(zhì)分子發(fā)生重排，肌球蛋白活性部位的巰基氧化也可能引起Ca2+-ATPase活性降低[13，32-33]。此外，凍藏期間肌球蛋白分子發(fā)生聚合，頭部結(jié)構(gòu)被掩蓋，與ATP接觸概率降低，催化ATP脫磷反應(yīng)的活性也同時降低[34]。王陽光等[35]在研究速東方式對梭子蟹儲藏期理化性質(zhì)的影響中也發(fā)現(xiàn)，速凍溫度越低，Ca2+-ATPase活性下降速度越慢。這與本研究結(jié)果一致，表明液氮速凍能更好地降低蟹肉蛋白質(zhì)的變性程度。

綜上所述，凍結(jié)方式對中華絨螯蟹蟹肉生化特性和感官品質(zhì)有顯著影響。更低的凍結(jié)溫度能更有效地減緩蛋白質(zhì)變性和脂肪氧化。與-20℃、-40℃和-70℃速凍處理相比，液氮速凍方式可以最大限度地保持中華絨螯蟹蟹肉的品質(zhì)，特別適用于中華絨螯蟹的儲藏、運輸和加工。

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