高效液相色譜法測定燈盞細辛提取物中兩種有效成分的含量

李春平　歐春燕

（福建省東山縣醫(yī)院東山363400）

高效液相色譜法測定燈盞細辛提取物中兩種有效成分的含量

李春平歐春燕

（福建省東山縣醫(yī)院東山363400）

目的：探討燈盞細辛提取物中野黃芩苷、3，4-二-O-咖啡酰奎寧酸2種有效成分含量的高效液相色譜測定方法。方法：色譜柱選擇Dikma Kromasil C18（250mm×4.6mm，5.0μm），流動相選擇乙腈：0.2％磷酸溶液=30∶70，檢測波長為332nm，柱溫為35℃。結(jié)果：野黃芩苷的線性回歸方程為Y=1.554×103-0.201×102（r=0.9997）；3，4-二-O-咖啡酰奎寧酸的線性回歸方程為Y=1.724×103-0.081×102（r=0.9996）；野黃芩苷在0.0341～1.3121μg范圍內(nèi)，3，4-二-O-咖啡酰奎寧酸在0.0592～2.3426μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。結(jié)論：采用高效液相色譜法同時測定燈盞細辛提取物中2種有效成分的含量，操作簡單，精密度高，重現(xiàn)性好，可以作為燈盞細辛提取物中這2種有效成分的定量分析方法。

燈盞細辛提取物 野黃芩苷高效液相色譜法 3，4-二-O-咖啡酰奎寧酸

燈盞細辛為菊科（Asteraeeae）植物短葶飛蓬Erigeron breviscapus（Vant.）Hand-Mazz.的干燥全草[1]。燈盞細辛多用于治療多種眼科疾病，具有確切的臨床療效。有研究表明[2]，一些含有燈盞乙素的中藥，如唇形科植物高黃芩、黃芩等未顯示與燈盞細辛同等的功效，其中有文獻報道[3]對燈盞細辛化學成分進一步系統(tǒng)研究后發(fā)現(xiàn)了燈盞細辛中含有較多的酚酸類化合物，其中包括了3，4-二-O-咖啡酰奎寧酸、3，5-二-O-咖啡酰奎寧酸、飛蓬酯乙等，均表現(xiàn)出與燈盞乙素同等的生物活性，是燈盞細辛中一類重要的有效成分。因此，本研究對燈盞細辛中野黃芩苷、3，4-二-O-咖啡酰奎寧酸2種有效成分進行含量測定，為臨床用藥提供參考。

1　儀器與試藥

1.1實驗儀器：日本Agilent1100 series高效液相色譜儀，其中包括DAD檢測器、四元泵、柱溫箱、在線真空脫氣機、自動進樣器，色譜工作站為Agilent Chemstation色譜系統(tǒng)。美國梅特勒公司生產(chǎn)的電子分析天平（精密度為0.0001g），SZ-98型自動雙重純水蒸餾器（上海亞榮儀器廠），KQ5200型超聲波清洗器（北京超聲儀器公司）。

1.2實驗試劑及試藥：野黃芩苷對照品（生產(chǎn)批號120148-20150223）、3，4-二-O-咖啡酰奎寧酸（生產(chǎn)批號06-20120525，純度≥98％）均購于中國食品藥品檢定所，實驗用水為三蒸水，乙腈、甲醇溶液為色譜純，其他試劑均為分析純。燈盞細辛藥材購于我市中藥材收購站，并有專家鑒定為真品。燈盞細辛提取物為研究過程中自制（主要步驟為燈盞細辛藥材適量，粉碎機碎成粉末后加入20倍量水浸泡40min后，煮沸提取60min，過1.5倍藥材量的AB-8型大孔吸附樹脂，以水洗至洗脫液無色，以5倍樹脂體積的70％乙醇溶液洗脫，70％乙醇洗脫液回收溶劑，減壓干燥后研磨成粉末）。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件的選擇：色譜柱Dikma Kromasil C18（250mm× 4.6mm，5.0μm），流動相選擇乙腈：0.2％磷酸溶液=30∶70，檢測波長為332nm，柱溫為35℃，進樣量為15μL，以野黃芩苷的色譜峰作為參考，理論塔板數(shù)>4000，見圖1。

2.2對照品溶液的制備：取2種有效成分對照品適量，精密稱定后置于10mL容量瓶中，甲醇溶液定溶至刻度后即得對照品溶液，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3供試品溶液制備：取燈盞細辛提取物0.01g精密稱定后置于50mL容量瓶中，甲醇溶液20mL，超聲后放冷后甲醇溶液定溶至刻度，搖勻后過0.22μm微孔濾膜后，濾液即為供試品溶液。

2.4線性關(guān)系考察：分別取“2.2”項下的2種有效成分對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL置于10mL容量瓶中，甲醇溶液定溶至刻度后搖勻。按照“2.1”項下的色譜條件進樣，以峰面積為縱坐標，對照品含量為橫坐標，得到線性回歸方程分別為：野黃芩苷Y=1.554×103-0.201×102（r=0.9997），在0.0341～1.3121μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；3，4-二-O-咖啡酰奎寧酸Y=1.724×103-0.081× 102（r=0.9996），在0.0592～2.3426μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5精密度考察：精密吸取“2.2”項下的2種有效成分對照品溶液，按照“2.1”項下的色譜條件重復(fù)進樣5次，結(jié)果表明野黃芩苷、3，4-二-O-咖啡酰奎寧酸RSD值分別為1.24％、0.98％，表明儀器的精密度較好。

2.6穩(wěn)定性考察：取燈盞細辛提取物，按照“2.3”項下的供試品溶液配制方法制成供試品溶液后分別在0、2、4、6、8、10、12、24、36h時按照“2.1”項下的色譜條件分別進樣，結(jié)果表明野黃芩苷、3，4-二-O-咖啡酰奎寧酸RSD值分別為1.12％、0.85％，表明在36h內(nèi)供試品溶液的穩(wěn)定性較好。

2.7重復(fù)性考察：取同一批次的燈盞細辛提取物5份，按照“2.3”項下的供試品溶液制備方式配制成供試品溶液，測定野黃芩苷、3，4-二-O-咖啡酰奎寧酸峰面積的RSD值分別為1.32％、0.87％，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.8加樣回收率試驗：取已知含量的樣品4份精密稱定，分別加入定量的野黃芩苷、3，4-二-O-咖啡酰奎寧酸對照品，置于50mL容量瓶中，甲醇溶液定溶至刻度，搖勻靜置后，按照“2.1”項下的色譜條件繪制色譜圖，并根據(jù)線性回歸方程計算含量，見表1。

表1　燈盞細辛提取物中2種有效成分加樣回收率試驗

2.9含量測定：取不同批次的燈盞細辛提取物，按照“2.3”項下的配制條件制備供試品溶液，測定3批燈盞細辛提取物中2種有效成分的含量，結(jié)果見表2。

表2　燈盞細辛提取物中2種有效成分的含量（n=3）

3　討論

3.1流動相的選擇：根據(jù)參考文獻[4]，本試驗研究中分別以甲醇：水、乙腈：水為流動相進行考察，結(jié)果表明因2種有效成分均為微酸性，流動相中需要加入一定量的酸以防止拖尾現(xiàn)象，所以在流動相中加入了0.2％磷酸溶液。實驗表明，乙腈：0.2％磷酸溶液在30∶70時2種有效成分的色譜峰顯著分離。

3.2檢測波長的選擇：實驗中采用了DAD在220～400nm波長范圍內(nèi)進行紫外掃描，野黃芩苷和3，4-二-O-咖啡酰奎寧酸的最大吸收波長范圍在324～338nm之間[5]，在本次實驗過程中選擇332nm作為檢測波長。

總之，采用高效液相色譜法測定燈盞細辛提取物中2種有效成分，操作簡單，精密度好，重現(xiàn)性高，可以作為燈盞細辛提取物中這2種有效成分的定量分析方法。

[1]路雪倩，張富文，張藝，等.燈盞細辛總黃酮對視神經(jīng)的保護作用[J].中藥新藥與臨床藥理，2011，22（5）：510-514.

[2]任琦，謝媛媛，祖雙，等.燈盞細辛中多酚類成分定性、定量的分析[J].藥物分析雜志，2013，33（7）：1175-1177.

[3]張靜.燈盞細辛制劑神經(jīng)保護活性-化學對比研究[J].成都中醫(yī)藥大學學報，2012，33（4）：68-71.

[4]楊菲，王智民.“一測多評”法測定丹參酚酸類成分的含量[J].中國中藥雜志，2011，36（17）：2373.

[5]何兵，田吉，劉艷，等.高效液相色譜法同時測定楤木不同部位4種成分的含量[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2011，31（21）：1820-1822.

The High Performance Liquid Chromatography in the determination of the content of two kinds of active ingredients in Erigeron breviscapus extract

Li Chunping Ou Chunyan（Dongshan County Hospital of Fujian province Dongshan 363400）

Objective：To investigate the High Performance Liquid Chromatography in the determination of the content o Scutellarin and Isochlorogenic acid B f two kinds of active ingredients in Erigeron breviscapus extract.Methods：The Column Selection was Dikma Kromasil C18（250mm×4.6mm，5.0μm），the mobile phase was acetonitrile：0.2％phosphoric acid solution=30∶70，the detection wavelength was 332nm，the column temperature was 35℃.Results：The scutellarin linear regression equation was：Y=1.554×103-0.201×102（r=0.9997）;Isochlorogenic acid B regression equation was：Y=1.724×103-0.081×102（r=0.9996）;scutellarin was at the range of 0.0341～1.3121μg，3，4-O-dicaffeoylquinic range was 0.0592～2.3426μg，which showed a good linear relationship.Conclusion：The HPLC method for the determination of the content of two kinds of active ingredients in Erigeron breviscapus extract is simple and easy operation，with high precision，reproducibility，and can be used as a quantitative analysis method for the two kinds of active ingredients in Erigeron breviscapus extract.

Erigeron breviscapus extract Scutellarin HPLC Isochlorogenic acid B

R927.2

A

1672-8351（2016）10-0008-02