注射用重組人鈣調蛋白磷酸酶B亞基成品鑒別試驗方法的建立

程白冰

摘要：目的建立注射用重組人鈣調蛋白磷酸酶B亞基（rhCNB）成品鑒別試驗方法，進行方法學驗證并進行多批樣品檢測；方法：參考《中國藥典》2010年版三部附錄Ⅷ A免疫印跡法建立本品抗原特異性鑒別方法。結果：本方法專屬性、耐用性良好；結論：本法適用于重組人鈣調蛋白磷酸酶B亞基成品鑒別試驗項檢測。

關鍵詞：免疫印跡法；重組人鈣調蛋白磷酸酶B亞基（rhCNB）；鑒別試驗；

【中圖分類號】-3 【文獻標識碼】A 【文章編號】2107-2306（2019）02-148-02

前言

鈣調蛋白磷酸酶B亞基（CNB）是鈣調蛋白磷酸酶（Calcineurin，CN）的調節亞基。rhCNB新藥項目由海口奇力制藥和北京師范大學聯合開發，參考中國藥典收載的注射用重組人白介素等同類品種的質量標準，鑒別試驗項是此類重組生物制品必控質量項目，本文探討該項方法的建立、方法學驗證及樣品檢測應用。

一、材料與試劑

儀器：伯樂公司PowerPac Basic基礎型電泳儀、伯樂公司Mini-Protean Tetra小型垂直電泳、伯樂公司Trans-Blot轉印槽、上海嘉鵬ZF-258凝膠成像系統；試劑：牛血清白蛋白、Tris、甘氨酸、甲醇、氯化鈉、鹽酸、聚山梨酯80，均為分析純；供試品：6批注射用重組人鈣調蛋白磷酸酶B亞基，均為海口奇力研發中心制備；對照品：重組人鈣調蛋白磷酸酶B亞基，為海口奇力自制。

二、實驗方法

1、溶液配制

TG緩沖液：稱取三羥甲基氨基甲烷15.12g，甘氨酸72g，加水溶解并稀釋至500ml，4℃保存。

EBM緩沖液：量取TG緩沖液20ml，加甲醇40ml，再加水稀釋至200ml，4℃保存

TTBS緩沖液：稱取三羥甲基氨基甲烷6.05g，氯化鈉4.5g，量取聚山梨酯80 0.55ml，加適量水溶解，用鹽酸調pH值至7.5，加水稀釋至500ml，4℃保存。

封閉液：含10%牛白蛋白的TTBS緩沖液。

供試品溶液：取供試品1瓶加入滅菌注射用水適量復溶并轉移至10ml量瓶中，加水稀釋至刻度，量取該溶液30μl，置1.5ml EP管中，加入供試品緩沖液10μl，混勻，即得供試品溶液。

對照品溶液：取重組人鈣調蛋白磷酸酶B對照品1瓶，量取適量加水定量稀釋制成蛋白濃度為0.2 mg/ml的溶液，量取該溶液30μl，置1.5mlEP管中，加入供試品緩沖液10μl，混勻，即得對照品溶液。

2、測定法

電泳：照SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，供試品與陽性對照品上樣量為1μg。

轉膜：①電泳結束后把膠小心剝離玻璃板，切去凝膠邊緣。放入已準備好的浸泡于EBM緩沖液中30分鐘。②準備1張硝酸纖維素膜（以下稱NC膜），剪成與膠同樣大小、2張厚濾紙，用EBM緩沖液浸泡1分鐘。③按轉膜裝置陰極板、墊層紗布、厚濾紙、電泳凝膠、NC膜、厚濾紙、墊層紗布、陽極板的順序把裝置裝好，濾紙、凝膠、NC膜精確對齊，并去除氣泡，夾緊。④裝入轉印槽，放入冷卻盒。倒入約1000mlEBM緩沖液，以恒流80mA的條件電轉45min。

免疫檢測：①把已轉好的膜放入封閉液中室溫封閉60分鐘。②棄去封閉液，加入一抗溶液[取rhCNB抗體1支，加水200μl溶解，混勻，量取50μl，置燒杯中，加入TTBS緩沖液5ml，混勻即得。室溫過夜。③棄去一抗溶液，用TTBS緩沖液淋洗NC膜1次，再用TTBS緩沖液洗膜3次，每次8分鐘；再加入用TTBS緩沖液稀釋好的二抗1支，取5μl，置小燒杯中，加入TTBS緩沖液4ml，混勻即得，室溫放置40min。④用TTBS緩沖液淋洗NC膜1次，再用TTBS緩沖液浸洗3次，每次8分鐘；⑤取DAB試劑盒中HRP反應緩沖液1ml，試劑A、試劑B、試劑C各50μl，混勻于燒杯，放入NC膜，避光顯色15分鐘。

掃描與結果保存：顯色后使用凝膠成像系統按其標準操作規程掃描并保存結果圖像，NC膜室溫晾干并貼于檢驗記錄相關區域。

結果判斷：陽性結果應呈現明顯條帶，陰性結果無條帶。

三、方法建立及方法學驗證

1、供試品抗體稀釋度、HRP標記抗體稀釋度、供試品點樣量預試驗

【供試品單克隆抗體稀釋度試驗】委托南京金斯瑞生物科技有限公司制備rhCNB單克隆抗體，按《中國藥典》2010年版三部附錄Ⅷ A免疫印跡法進行試驗。試驗結果表明，1.025μg/ml至8.20μg/ml濃度的一抗均能顯色，抗體濃度為4.1μg/ml和8.2μg/ml的圖譜顯示效果較好，選擇4.1μg/ml為本法一抗稀釋濃度。

【供試品點樣量選擇試驗】根據《中國藥典》的要求，供試品與陽性對照品上樣量應大于100ng，為了得到準確、清晰、可靠的檢測結果，以0.2μg、0.5μg、1.0μg、1.5μg、2.0μg供試品點樣量分別試驗。結果表明，點樣量為1.0μg結果條帶清晰，大小適中，確定本法供試品點樣量為1.0μg。

2、方法學驗證

【專屬性試驗】配制對照品、供試品及無rhCNB的牛白蛋白溶液，依本法測定，記錄結果。試液配制方法：①供試品溶液的制備：取供試品1瓶，加入滅菌注射用水溶解并轉移至10ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，量取該溶液30μl，置1.5ml EP管中，加入4×非還原型供試品緩沖液10μl，混勻即得供試品溶液。②對照品溶液的制備：取rhCNB工作對照品1瓶，加水溶解并轉移至100ml量瓶中，加水稀釋至刻度，制得蛋白濃度為0.2mg/ml的溶液，量取該溶液30μl，置1.5ml EP管中，加入非還原型供試品緩沖液（4×）10μl，混勻即得對照品溶液。③按本品制劑處方配制不含rhCNB的溶液，加入牛白蛋白制成無rhCNB的牛白蛋白溶液量取該溶液30μl，置EP管中，加入4×非還原型緩沖液10μl，混勻，制得牛白蛋白對照溶液。

檢測結果顯示rhCNB對照品與供試品均能有效檢出條帶，結果為陽性，白蛋白不顯色，結果為陰性，滿足專屬性試驗要求。

【耐用性試驗】

設置一抗濃度0.45μg/ml（正常濃度的90%）、0.55μg/ml兩個濃度。免疫檢測：①把已轉好的膜放入封閉液中封閉60分鐘。②棄去封閉液，分別加入一抗溶液（取rhCNB抗體2支，各加水200μl復溶，混勻，分別量取4.45μl、5.44μl，各置小燒杯中，各加入TTBS緩沖液5ml，混勻制得一抗濃度分別為0.45μg/ml、0.55μg/ml。）室溫過夜。③棄去一抗，用TTBS緩沖液淋洗NC膜1次，再用TTBS緩沖液洗膜3次，每次8分鐘；再加入用TTBS緩沖液稀釋好的二抗（取分裝好的二抗（羊抗小鼠）2支，各取5μl，置小燒杯中，各加入TTBS緩沖液4ml，混勻即得），室溫放置40分鐘。④用TTBS緩沖液淋洗NC膜1次，再用TTBS緩沖液浸洗3次，每次8分鐘；⑤取DAB試劑盒中HRP反應緩沖液2ml，試劑A、試劑B、試劑C各100μl，混勻于燒杯，放入NC膜，避光顯色15分鐘。

結果表明，抗體配制濃度偏差±10%，對檢測結果無明顯影響，耐用性良好。

【方法學驗證結果】rhCNB免疫印跡法鑒別試驗有良好專屬性和耐用性，適用成品鑒別項檢查。

3、注射用rhCNB成品鑒別試驗檢測結果

按本法檢測連續6批注射用rhCNB鑒別試驗。結果均呈陽性，均符合本品《制造與檢定規程》（草案）的規定。

四、討論

根據《人用重組DNA制品質量控制技術指導原則》【6】的要求，并參照國內已上市重組蛋白類藥物，如注射用重組人干擾素α2a、重組人白介素-2注射液、注射用重組人粒細胞刺激因子等，均建有鑒別試驗檢查項，方法為免疫印跡法或免疫斑點法。

按《生物制品質量控制分析方法驗證技術審評一般原則》進行該方法的專屬性、耐用性驗證，驗證結果良好。6批注射用rhCNB樣品檢測結果呈陽性，均符合本品《制造與檢定規程》（草案）的規定。

五、結論

該專屬性、耐用性良好，適用于注射用rhCNB成品制劑鑒別試驗檢測。

參考文獻

[1] 國家藥品審評中心[S]GPH1-1《生物制品質量控制分析方法驗證技術審評一般原則》

[2] 含有鈣調神經磷酸酶B亞基的藥物組合物 中國專利

[3] 中國藥典.三部[S].2010.

[4] 《人用重組DNA制品質量控制技術指導原則》 藥審中心 2003年