遼西驢細管冷凍精液稀釋液配方篩選試驗

武師良 張立斌 劉興偉 張興會 王曉銘 李鳳軍 張曉鷹

摘要：試驗以3個細管凍精稀釋液配方為基礎，進行配方初選試驗、不同防凍劑比較試驗、同一防凍劑不同含量比較試驗，比較了不同條件下細管凍精的制作效果，進而篩選出效果較好的遼西驢細管凍精稀釋液配方。

關鍵詞：遼西驢;冷凍精液;稀釋液配方

中圖分類號：S822 文獻標識碼：B

doi： 10.3969/j.issn.2096-3637.2019.21.008

0 引言

隨著遼西驢飼養數量的增加，對遼西驢肉用品種進行種源選育、加強保種工作提上日程，為防止近交退化、雜交亂配造成的群體退化、生產性能下降，項目組于2019年6-8月開展遼西驢細管冷凍精液的制作研究，為提高遼西驢細管凍精的制作效果，在試驗初期開展了遼西驢細管冷凍精液稀釋液配方篩選試驗，結果、結論如下。

1 材料與方法

1.1 精液來源

研究中使用的精液來源于建平縣芮林牧業有限公司的4頭種公驢。

1.2 試驗藥品

主要為分析純無機鹽、糖類、乙二醇、甘油[1]等試劑及抗菌素等。

1.3 試驗器材

400～600倍光學顯微鏡[2]、離心機、恒溫水浴鍋、超低溫溫度儀、控溫冰箱、電子天平、0.5 mL與0.25 mL細管[3]等。

1.4 試驗方法

1.4.1 篩選冷凍稀釋液

冷凍稀釋液包括以乙二醇為防凍劑的初選配方;以等量甘油替代乙二醇為防凍劑的二次篩選配方;不同含量的防凍劑的優化配方。各配方具體成分如表1、表2、表3。

1.4.2 稀釋溶液配制

原精離心液配制：蔗糖分析純試劑110g，加蒸餾水1000mL煮沸至蔗糖全部溶解。

冷凍稀釋液配制：準桷稱量各配方中的基礎試劑煮沸溶解制成溶液，常溫冷卻后加入抗菌素和卵黃，攪拌均勻。

1.4.3 精液離心與稀釋2

原精經紗布（6～8層）過濾后，按1：1體積比例加入離心液，緩慢均勻混合后，裝入離心管，在（30±4） ℃范圍內以2000r/min離心10 min;離心后精液棄去上清液后在干凈的容器內按1：1～1：2比例加入冷凍稀釋液，等溫緩慢混勻。

1.4.4 降溫平衡

稀釋后的精液放入緩沖容器內，封口，進行降溫平衡。

1.4.5 精液冷凍溫度

初凍溫度分別設置為（90±5）℃，凍精細管變成乳白色時全部浸入液氮中。

1.4.6 細管凍精解凍及質量檢測

解凍后，在37℃環境下檢查活力、頂體完整率和存活時間。

1.4.7 分析方法

采用SPSS軟件進行統計分析，用LSD法多重比較各處理的差異性。

2 結果與分析

2.1 不同稀釋液初選配方冷凍效果比較

3個稀釋液配方A1， B1， C1中，B1解凍后活力最低，其次為Al， C1， Cl與Al比較，差異顯著（P<0.05） ， B1與A1、C1比較，差異極顯著（P<0.01） ;解凍后頂體完整率從高到低依次為C1、A1、B1，其中，C1、A1之間差異顯著（P<0.05），B1與A1，C1比較，差異極顯著（P<0.01）;解凍后38℃下存活時間，從長到短依次為C1、A1、B1，其中，C1、A1之間差異顯著（P<0.05），B1與A1、C1比較，差異極顯著（P<0.01）。據此，以C1配方為首選配方。

2.2 凍精稀釋液配方第2次篩選

用等量的甘油替代乙二醇作為防凍劑，冷凍后精子活力A2>Al， B2>B1， C2>C1，并且A2>Al， B2>B1達到了顯著水平（P<0.05） ，解凍后精子的解凍完整率A2>A1， B2>B1， C2>C1，并且均達到了顯著水平（P<0.05），凍精解凍后在38℃下存活時間A2>A1， B2>B1， C2>C1，各比較組P>0.05，差異不顯著。采用用等量的甘油替代乙二醇作為防凍劑可提高遼西驢細管凍精的綜合質量。

2.3 優化稀釋液配方中不同甘油濃度對凍精質量的影響

C23配方（甘油含量為5mL）時，冷凍后活力，凍后的頂體完整率、存活時間都比其它各組高，其中，C23的精子冷凍后活力較C21相比，差異極顯著（P<0.01 ） ，與C22、C25相比較，差異達顯著水平（P<0.05），與C24比較，差異不顯著（P>0.05）;C23方的凍后頂體完整率，與C21、C22、C25相比較，差異顯著（P<0.05 ），與24比較差異不顯著（P>0.05）;精子解凍后在38℃下存活時間以C23組最高，C23與C21比較，差異達極顯著水平（P<0.01），C23與C22、C25比較，差異達顯著水平，C23與C24比較，差異不顯著（P>0.05）。甘油的添加量以5mL最為適宜。

3 討論與結論

（1）以甘油為冷凍劑的配方（葡萄糖1.2g、檸檬酸1.3g、Tris2.4g、甘油5mL、卵黃20mL、雙蒸餾水100mL、青鏈霉素各1×105IU）可為制作遼西驢細管冷凍精液的首選配方。

（2）試驗是以含有乙二醇或甘油為防凍劑的凍精稀釋液采取一次性稀釋精液的基礎上進行的，沒有進行精液二次稀釋試驗，而凍精稀釋液最終配方為含有甘油防凍劑的稀釋液，據相關報導，甘油對精子最有一定的毒性作用，而采取二次稀釋法可以降低甘油對精子的毒副作用。與一次稀釋相比，二次稀釋可能使遼西驢細管凍精的冷凍效果進一步提升，因此，尚需開展二次稀釋試驗，以驗證篩選出凍精稀釋液配方的冷凍效果。

（3）試驗是在3個初選配方的篩選后更換防凍劑的基礎上進行，由于不同的稀釋液的滲透壓、pH值及對精細胞的保護作用都是不同的，因此，試驗結論尚不能作為最終結論，還需進一步開展試驗進行完善。

參考文獻

[1] 楊莉，于杰，李海靜，等.驢精液低溫冷凍技術及應用進展[J].黑龍江畜牧獸醫，2016（20）：80-81.

[2] 古麗海a，高斐.驢精液常溫保存的研究[J].新疆畜牧業，2014 （11）：14-16.

[3] 王慧偉.驢精液保存技術研究[D].烏魯木齊：新疆農業大學，2008.

基金項目：遼寧省中央引導地方科技發展專項-遼西驢品種種系發生、分子鑒定及保種研究（2019416032）

作者簡介：武師良（1985-），男，農業推廣碩士.畜牧師，研究方向：動物育種。

通信作者：劉興偉（1965-） ，男，教授，研究員，畜牧師，研究方向：選育繁殖飼養。