多重PCR技術(shù)檢測(cè)小兒咽拭子呼吸道病毒的臨床分析

樊旭成 韓志國(guó) 薛娜

摘要：目的? 研究多重?zé)晒饩酆厦告準(zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)對(duì)小兒咽拭子呼吸道病毒、病原菌檢測(cè)的應(yīng)用價(jià)值。方法? 篩選2018年1月～12月到烏魯木齊市社區(qū)服務(wù)門診就診的社區(qū)獲得性肺炎（CAP）患兒524例，采用多重PCR技術(shù)檢測(cè)患兒咽拭子病原菌，分析CAP病原菌的分布情況及其與年齡、季節(jié)等的關(guān)系。結(jié)果? CAP病原檢測(cè)結(jié)果大部分屬于病毒性，以乙型流感病毒、肺炎衣原體、肺炎支原體等為主，細(xì)菌類以肺炎克雷伯菌等為主;與患兒年齡、季節(jié)有關(guān)，3歲以下患兒仍是CAP的主要發(fā)病年齡段，尤其是嬰幼兒最多，發(fā)病多集中在秋季和冬季;2種以上病原混合感染形式嚴(yán)峻。結(jié)論? 多重PCR技術(shù)對(duì)小兒咽拭子病原菌檢測(cè)的應(yīng)用效果良好，快捷方便。

關(guān)鍵詞：多重PCR技術(shù);小兒咽拭子;呼吸道病毒;病原菌

中圖分類號(hào)：R373.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.15.039

文章編號(hào)：1006-1959（2019）15-0119-04

Abstract：Objective? To study the application value of multiplex fluorescent polymerase chain reaction （PCR） in the detection of respiratory viruses and pathogens in children with throat swabs.Methods? A total of 524 children with community-acquired pneumonia （CAP） who were treated in the community service clinic in Urumqi from January to December 2018 were enrolled. The phage swab pathogens were detected by multiplex PCR and the distribution of CAP pathogens was analyzed. Relationship between age， season， etc.Results? Most of the results of CAP pathogen detection were viral， mainly influenza B virus， Chlamydia pneumoniae， Mycoplasma pneumoniae， and bacteria such as Klebsiella pneumoniae; related to age and season of children， under 3 years old children are still the main age of onset of CAP， especially in infants and young children. The incidence is mostly concentrated in autumn and winter; the mixed forms of more than two pathogens are severe.Conclusion? The multiplex PCR technique has a good effect on the detection of pathogenic bacteria in children's throat swabs， which is quick and convenient.

Key words：Multiplex PCR technology;Pediatric throat swab;Respiratory virus;Pathogen

社區(qū)獲得性肺炎（community acquired pneumonia，CAP）屬于呼吸系統(tǒng)疾病，在小兒科極為常見，是導(dǎo)致兒童死亡的重要疾病之一。據(jù)報(bào)道，在一些發(fā)達(dá)國(guó)家，<5歲的兒童肺炎發(fā)病率約為4.00%[1]。我國(guó)每年有2000萬(wàn)左右的兒童罹患肺炎，大約30萬(wàn)5歲以下兒童死亡，是導(dǎo)致國(guó)內(nèi)嬰幼兒死亡的首位疾病[2]。由于CAP的病因復(fù)雜，對(duì)患兒的病原確認(rèn)存在一定困難，而在無(wú)法明確病原的情況下，醫(yī)務(wù)工作者常根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)治療，易導(dǎo)致不合理用藥，造成嚴(yán)重影響。近年來(lái)對(duì)呼吸道疾病，多重?zé)晒饩酆厦告準(zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)在小兒咽拭子病原菌檢測(cè)方面，具有簡(jiǎn)便、快捷、靈敏度高、兒童接受度好等優(yōu)點(diǎn)[3]。本文主要研究多重PCR技術(shù)在小兒咽拭子呼吸道病毒、病原菌檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值，報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料? 篩選2018年1～12月到烏魯木齊市社區(qū)門診就診的CAP患兒。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡28 d～12歲，性別不限;②依據(jù)最新版《兒童社區(qū)獲得性肺炎管理指南》確診為CAP。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有其他基礎(chǔ)性疾病;②肺結(jié)核病;③先天性免疫缺陷。最終符合入選標(biāo)準(zhǔn)的患兒共524例，其中男273例，女251例。將所有研究對(duì)象按年齡分為：≤1歲組176例、1～3歲組129例、3～5歲組117例、>5歲組102例。將所有研究對(duì)象按季節(jié)分組：春季組104例、夏季組75例、秋季組176例、冬季組169例。

1.2方法? 咽拭子標(biāo)本采集：專業(yè)工作者一只手用壓舌板壓住舌根，另一只手用消毒棉簽輕快地拭擦咽、扁桃體以及兩側(cè)腭弓，把棉簽置入病毒采樣液試管內(nèi)（插入前快速消毒試管口），及時(shí)送至烏魯木齊市疾病預(yù)防控制中心病毒實(shí)驗(yàn)室采用多重PCR技術(shù)檢測(cè)。

1.3觀察指標(biāo)? 采用多重PCR技術(shù)檢測(cè)CAP的各種病原，包括細(xì)菌性病原、病毒性病原以及其他非典型病原。檢測(cè)出感染病原即為陽(yáng)性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理? 使用SPSS 21.0對(duì)本研究數(shù)據(jù)作統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用（x±s）表示，使用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用（%）表示，使用？字2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1病原學(xué)構(gòu)成? 在524例CAP患兒中，共有502例病原檢測(cè)呈陽(yáng)性，檢出率95.80%。其中細(xì)菌類51例，2種以上細(xì)菌混合感染共6例;病毒類414例陽(yáng)性，2種以上病毒混合感染148例;細(xì)菌性和病毒性混合感染16例。混合感染205例。病原結(jié)果分布及在524例患兒中占比見表1。

2.2年齡與病原的關(guān)系

2.2.1年齡與病毒性病原的關(guān)系? 每個(gè)年齡組均是乙型流感病毒、肺炎支原體、肺炎衣原體、腺病毒最多。肺炎支原體分布以>5歲兒童為主，與1～3歲兒童比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;呼吸道合胞病毒分布以≤1歲兒童為主，與>5歲兒童比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;乙型流感病毒分布以大年齡兒童為主，其他三個(gè)年齡段的發(fā)病率均高于≤1歲兒童，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;2種以上病毒的混合感染≤1歲兒童的發(fā)病率均低于1～3歲兒童、>5歲兒童，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），年齡越大的兒童有2種以上病原的混合感染可能性越大，見表2。

2.2.2年齡與細(xì)菌性病原的關(guān)系? ≤1歲兒童：肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸埃希菌較多;1～3歲兒童：銅綠假單胞菌較多;3～5歲兒童：細(xì)菌性感染較少;>5歲兒童：肺炎克雷伯菌較多。金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、肺炎鏈球菌在不同年齡段的發(fā)病率以年齡較小的兒童為主，尤其是≤1歲兒童，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

2.3季節(jié)與病原的關(guān)系

2.3.1季節(jié)與病毒性病原的關(guān)系? 春夏季較秋冬季肺炎支原體的感染更容易，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;相對(duì)于春季，乙型流感病毒分布以秋冬季為主，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;發(fā)生2種以上病毒的混合感染冬季相對(duì)于春夏秋季的可能性較小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表4。

2.3.2季節(jié)與細(xì)菌性病原的關(guān)系? 在冬季較易感染肺炎鏈球菌，銅綠假單胞菌好發(fā)于春季，見表5。

3討論

本研究顯示，烏魯木齊市社區(qū)服務(wù)門診獲得性肺炎病原檢測(cè)結(jié)果大部分屬于病毒性，以乙型流感病毒、肺炎衣原體、肺炎支原體等為主，細(xì)菌類以肺炎克雷伯菌等為主;與患兒年齡、季節(jié)有關(guān)，3歲以下患兒仍是CAP的主要發(fā)病年齡段，尤其是嬰幼兒最多，而肺炎支原體、乙型流感病毒分布以5歲以上兒童為主，細(xì)菌性感染以年齡較小的兒童為主，年齡越大的兒童有2種以上病原的混合感染可能性越大，發(fā)病多集中在秋季和冬季;2種以上病原混合感染形式嚴(yán)峻。研究顯示，呼吸道感染與氣象環(huán)境變化相關(guān)，并存在一定的滯后性，低溫、大風(fēng)、干燥易導(dǎo)致呼吸道感染[4]。楊湛[5]的研究發(fā)現(xiàn)，除肺炎衣原體外的其它呼吸道病原體的感染率有季節(jié)差異，乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎支原體以及嗜肺軍團(tuán)菌Ⅰ型好發(fā)于冬季，副流感病毒、腺病毒、Q熱立克次體及甲型流感病毒感染常見于秋冬季。分析顯示，由于季節(jié)氣候的影響，乙型流感病毒感染期間甲型流感病毒、腺病毒感染幾率也會(huì)增加;肺炎支原體感染期間腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、嗜肺軍團(tuán)菌感染幾率也會(huì)增加;細(xì)菌性病原感染與溫度有關(guān)，肺炎鏈球菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌與溫度呈統(tǒng)計(jì)學(xué)負(fù)相關(guān)，每下降0.021℃，可能增加1例大腸埃希菌或者肺炎鏈球菌感染患者;每下降0.035℃，金黃色葡萄球菌感染幾率增加[6-8]。

由于兒童CAP病原學(xué)復(fù)雜，尤其是2種以上病原的混合感染容易引起漏診，對(duì)臨床的診療造成困擾，此種情況下醫(yī)務(wù)人員常根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)施與治療，從而導(dǎo)致藥物的不合理使用，增加其經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，造成資源浪費(fèi)，給患兒及其家屬帶來(lái)身心上的傷害，甚至影響患兒的生長(zhǎng)發(fā)育。有報(bào)道稱，隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，兒童抗生素?cái)?shù)量和種類不斷增多，同時(shí)兒童抗生素濫用的問題也日益嚴(yán)重，導(dǎo)致不良反應(yīng)增加、細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)、藥品資源浪費(fèi)等各種嚴(yán)重問題，嚴(yán)重危害患兒健康帶來(lái)[9]。

多重PCR技術(shù)檢測(cè)咽拭子呼吸道病毒，過程主要分為呼吸道病毒酸提取及多重體系檢測(cè)。其原理是：在多重PCR的基礎(chǔ)上，結(jié)合媒介探針技術(shù)和多色熒光探針熔解曲線分析技術(shù)，建立單管的四色檢測(cè)體系，分析不同的熔解曲線解鏈溫度值，區(qū)分不同的呼吸道病毒以及病原菌，因此實(shí)現(xiàn)對(duì)單管多種病原菌的同時(shí)檢測(cè)[10，11]。

本文通過多重PCR技術(shù)對(duì)小兒咽拭子呼吸道病毒、病原菌進(jìn)行檢測(cè)，研究?jī)和疌AP病原菌與年齡、季節(jié)等的關(guān)系，以便作出準(zhǔn)確的診斷、合理的治療以及采取有效的、針對(duì)性的預(yù)防措施。對(duì)于CAP監(jiān)測(cè)，為可能暴發(fā)疫情的預(yù)測(cè)及預(yù)警提供了有價(jià)值的資料，是預(yù)防控制感染的先進(jìn)措施和關(guān)鍵策略。無(wú)論是單個(gè)病原感染或是多個(gè)合并感染，多重PCR檢查技術(shù)都能夠明確病原，對(duì)臨床診斷具有極大意義。根據(jù)多重PCR檢測(cè)結(jié)果，給迅速診斷提供準(zhǔn)確的參考，給患兒做出針對(duì)性的治療，使用相應(yīng)抗菌性的藥物或者抗病毒治療或者綜合治療措施，合理使用藥物，避免濫用抗生素，減少細(xì)菌耐藥性以及副作用的影響，讓患兒得到有利的治療，從而提高治愈率，減少痛苦和傷害，有利于社會(huì)和諧。

綜上所述，多重PCR技術(shù)對(duì)小兒咽拭子病原菌檢測(cè)的應(yīng)用效果良好，靈敏度高，快捷方便，小兒接受良好，檢查結(jié)果具有較高的參考價(jià)值。

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收稿日期：2019-3-15;修回日期：2019-3-25

編輯/張建婷