荷葉中荷葉堿的浸提動力學模型研究*

韓婷婷，任曉亮，任德飛，王 萌

（1.天津中醫藥大學中藥學院，天津 301617；2.天津中醫藥大學中醫藥研究院，天津 301617）

荷葉（Nelumbins Folium）系睡蓮科蓮屬植物蓮Nelumbo nucifera Gaertn的干燥葉[1]，味苦澀，性平，有清熱解暑，升發清陽，涼血止血的功效，用于暑熱煩渴，暑濕泄瀉、脾虛泄瀉，熱血吐衄，便血崩漏等[2]。中國自古以來就把荷葉奉為瘦身的良品。其被衛生部批準為“可用于保健食品的藥品”[3]。目前為止，從荷葉中已經鑒定出十五種生物堿，為荷葉堿、亞美罌粟堿、原荷葉堿、N-去甲基荷葉堿、番荔枝堿等，其中荷葉堿為中藥荷葉中的主要藥效活性成分[4-9]。荷葉堿（nuciferine）是一種阿樸啡型生物堿，現代藥理實驗證明荷葉堿具有明顯的降脂、平衡膽固醇導物、較強的抑制細菌和霉菌等以及在體外顯著的抗脊髓灰質炎病毒等活性[9-12]。目前有大量文獻記載了如何高效提取荷葉堿的方法，然而卻很少有從理論的角度出發研究其提取規律或者提取條件與提取量的關系變化。因此，本實驗選取溫度、溶劑種類及溶劑量作為考察內容，基于Fick第一定律建立動力學模型，對荷葉浸提動力學過程進行擬合，以期從理論上研究各因素與有效成分濃度之間的關系，并提高有效成分提取率。

1 材料

超高效相色譜儀（Waters ACQUITY UPLCTM，美國Waters公司）；高效液相色譜儀（Shimadzu LC-20AT，日本 Shimadzu公司）；實驗室超純水儀（Milli-QAcademic，美國 Millipore公司）；臺式高速離心機（TG16-WS，長沙湘儀離心機儀器有限公司）；電動攪拌器（S312-90，山海申生科技有限公司）；pH 計（PB-10，德國 Sartorius公司）；十萬分之一天平（BT125D，德國Sartorius公司）；電子天平（JA31002，上海精天電子儀器有限公司）；超聲波清洗器（KH3200B，昆山禾創超聲儀器有限公司）；數顯恒溫水浴鍋（HH-s8，金壇盛藍儀器制造有限公司）；藥典篩（2，4，5，6，7號篩，浙江上虞市五星沖壓篩具廠）。

荷葉堿（中國藥品生物制品檢定所，批號111566-2000703，含量 99.7%）；荷葉（山東，鑒定專家：天津中醫藥大學，李天祥教授）；乙腈（美國sigma公司，色譜純）；乙醇（天津市康科德科技有限公司，分析純）；甲酸（天津化學試劑批發公司，色譜純）；冰乙酸（天津市康科德技術有限公司，色譜純）；三乙胺（天津市元立化工有限公司，色譜純）；蒸餾水，屈臣氏集團有限公司。

2 方法與結果

2.1 色譜條件及方法學考察

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Waters SymmetryTMC18（150×3.9 mm，5μm）；流動相：乙腈-水-三乙胺-冰醋酸=27∶70.6∶1.6∶0.78；流速：1 mL/min；檢測波長：270 nm；進樣量10μL。對照品色譜圖見圖1。

圖1 荷葉堿對照品的HPLC圖

2.1.2 標準曲線的測定 精密稱量荷葉堿對照品4.04 mg，置于5 mL棕色容量瓶內，加甲醇稀釋至刻度，得到808μg/mL的荷葉堿標準品溶液；精密量取儲備液適量逐級稀釋4～1 026倍，得到0.787～202μg/mL的對照品溶液，由低到高濃度分別進樣10μL，記錄峰面積。

以荷葉堿質量濃度X（μg/mL）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標進行線性回歸，得線性回歸方程：Y=3.798 8×104X-2.1470×104（r=0.999 9），荷葉堿質量濃度在0.787～202μg/mL呈良好的線性關系。

2.1.3 精密度實驗 精密吸取對照品溶液（12.65μg/mL），連續進樣6次，以峰面積計，相對標準偏差（RSD）為1.4%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 重復性實驗 稱取10 g荷葉樣品置500 mL具圓底燒瓶，加入150 mL 95%乙醇，置恒溫水浴鍋中65℃浸提2 h，取樣適量離心（12 000 r/min，5min），上清經0.22μm微孔濾膜過濾，濾液稀釋進樣分析，平行制備6份，計算重復性為1.5%。

2.1.5 穩定性實驗 取荷葉樣品，配制好溶液，室溫放置，分別于 0、2、4、8、12、24 h 測定，RSD 為2.1%，樣品溶液在24 h內穩定。

2.1.6 加樣回收率測定 收集提取10 min時的樣品液，精密加入16.16μg/mL標準溶液，加樣回收率為98.73%，RSD為3.8%。

2.2 浸提動力學考察

2.2.1 干藥材吸收溶劑率的測定 取10 g干燥荷葉粗粉置三頸瓶中，向其中加入95%乙醇適量，浸提2 h，測定浸提后藥液體積，得荷葉吸收溶劑率3 mL/g。

2.2.2 不同溫度下浸提動力學研究 荷葉（取藥典5，6號篩之間的樣品）10 g置三頸瓶中，加入95%乙醇（溶劑量 150 mL）冷凝回流，水浴加熱，于 45、55、65、75℃提取，攪拌速度60 r/min，加入乙醇時計時于 5、10、20、30、40、60、80、100、120 min 取樣 1 mL（并補充溶劑），離心（15 000 r/min，2 min）取上清，過濾稀釋進樣。

2.2.3 不同溶劑體積下浸提動力學研究 荷葉（取藥典5，6號篩之間的樣品）10 g置三頸瓶中，加入95%乙醇冷凝回流，水浴加熱，加入溶劑體積分別為110、130、180、230 mL，65 ℃提取，加入乙醇時計時分別于 5、10、20、30、40、60、80、120 min 取樣 1 mL，離心（15 000 r/min，2 min）取上清，過濾稀釋進樣。

2.2.4 不同溶劑下浸提動力學研究 荷葉（取藥典5，6號篩之間的樣品）10 g置三頸瓶中，加入30、50、70、95%乙醇（溶劑量 150 mL）冷凝回流，水浴加熱，于 65 ℃提取，加入乙醇時計時于 5、10、20、30、40、60、80、120 min 取樣 1 mL（并補充溶劑），離心（15000 r/min，2 min）取上清，過濾稀釋進樣。

2.2.5 樣品濃度的測定 精密吸取不同浸提時間下的藥液離心（15 000 r/min，2 min），立即過 0.22μm濾膜，適量稀釋進樣分析。

2.3 數學模型的建立[13-19]中藥提取過程大致分為5個步驟：1）溶劑向荷葉藥材表面的擴散。2）溶劑向荷葉藥材內部的潤濕（內擴散）。3）藥材內部溶質的溶解。4）溶質從藥材內部向藥材表面擴散（內擴散）。5）藥材表面向溶液主體的擴散（外擴散）。其中步驟 1）、2）為溶劑滲透，3）為溶質溶解，4）、5）為溶質擴散。其中溶質擴散為天然藥物提取的限制步驟，步驟4的擴散為溶質擴散的主要控制步驟，浸提速率完全由步驟4決定。

基于Fick第一定律建模，基本假設：1）不考慮溶劑損失；2）荷葉顆粒是球形的，為單一成分恒溫提取。

S為固液界面積；dnB/dt為通過擴散面物質量的時間變化率；D為擴散系數。封閉體系中，濃度梯度隨時間變化以公式（1-2）表示。

將（1-1）帶入（1-2）：

對于稀溶液，濃度對擴散系數影響較小，對濃溶液擴散系數為濃度的函數。擴散系數與溶質濃度的冪呈正比：

D=D0DnB（n0）（1-4）

D0溶質的固有擴散系數。將（1-4）帶入（1-3），假設藥液中溶質B的初始溶度為0，t時刻nB=VCB，V為藥液體積。

藥材粉碎后顆粒數為k1，顆粒粒度e，藥材總干質量G，密度為d，

K為與藥物顆粒形狀有關的形狀參數，設K=k1/k2，得：

R：藥材吸收溶劑率，即藥材充分吸濕所需溶劑體積與干藥比值。將（1-8）、（1-9）帶入（1-5），

設U=1+b，

溶劑體積改變：公式（1-11）取對數得：

設：α=1/（1-n）ln[TtU/e]

β=1/（1-n）

公式（1-12）為中藥浸提動力學模型，表示浸出成分與溶劑量之間的關系。V：藥液體積；e：藥材顆粒粒度；M：干藥材加入溶劑體積與干藥材質量之比；D：擴散系數；R：藥材充分吸濕所需溶劑與干藥材質量之比。α、β為常數，lnC與ln（M-R）呈線性關系。

（1）浸提溫度改變

擴散系數與溫度的關系：擴散系數與溫度的關系：A為指前因子，E為擴散活化能，對于特定的系統，均為常數。令 m=KAa（1-n）/e（m-R），得：

兩邊取對數：

N為公式（1-15）展開項數。浸提溫度較高時，e-B/T近似為 1－B/T，將（1-15）帶入（1-14）得：

設：

當浸提溶劑量、藥材粒徑固定時，γ、δ為常數，lnCB與1/T呈線性關系。公式（1-17）為中藥浸提動力學模型，表示浸出成分與溫度之間的關系。

（2）浸提溶劑改變

采用一級一項動力學模型荷葉中荷葉堿動力學模型進行擬合，推到公式得：

C∞浸提平衡時溶液中功能成分的質量濃度度；C0浸提初始時溶液中功能成分質量濃；C隨時間t變化的溶液中功能成分質量濃度，設荷葉浸提初始時溶液中荷葉堿成分質量濃度為0。公式（1-18）為中藥浸提動力學模型，表示浸出成分隨時間變化規律。基本假設：荷葉堿擴散沿荷葉顆粒球體徑向進行，不同溶劑浸提過程中擴散系數為常數。

2.4 實驗結果

2.4.1 不同溫度對荷葉中荷葉堿浸提動力學考察不同溫度（45，55，65，75℃）下荷葉中荷葉堿浸提結果如表1所示，實驗范圍內，隨溫度升高，荷葉堿提取量增大。不同溫度下荷葉堿浸提曲線如圖2所示。動力學擬合方程以lnC-1/T×103作圖，結果如表2，圖3所示，擬合曲線（R＞0.95），線性關系良好，可用于描述不同溫度下荷葉中荷葉堿浸提動力學過程。

表1 不同溫度浸提荷葉堿含量與時間關系 μg/mL

圖2 不同溫度下荷葉堿浸提曲線

表2 不同溫度浸提動力學考察擬合方程（X=1/T，Y=lnC）

2.4.2 不同溶劑量對荷葉中荷葉堿浸提動力學考察 不同提取溶劑體積下，荷葉中荷葉堿浸提動力學考察結果如表3所示。溶劑量為110、130、180、230 mL，荷葉藥材吸收溶劑率為3，荷葉有效浸提溶劑倍量分別為 8、10、15、20 倍。

實驗范圍內，隨浸提體積增大，荷葉堿平衡提取量增大，浸提達到平衡的時間延長。不同溶劑量下荷葉堿浸提曲線如圖4所示。動力學擬合方程以lnC-ln（M-R）作圖，結果如表 4、圖 5 所示，擬合曲線（R＞0.95），線性關系良好，可用于描述不同浸提體積下荷葉中荷葉堿浸提動力學過程。

表3 不同溶劑體積浸提荷葉堿濃度與時間關系 μg/mL

圖3 不同溫度浸提動力學考察（lnC-1/T×103）

圖4 不同溶劑體積浸提動力學考察

2.4.3 不同溶劑對荷葉中荷葉堿浸提動力學考察不同提取溶劑（30%、50%、70%、95%乙醇）下，荷葉中荷葉堿浸提動力學考察結果如表5所示。實驗范圍內，不同溶劑提取過程中存在濃度交叉，70%乙醇具有最大提取速率、提取量，浸提曲線如圖6所示。動力學擬合方程以ln[C∞/（C∞-C）]-t作圖，結果如表6、圖7所示，擬合曲線R＞0.95，線性關系良好，可用于描述不同溶劑下荷葉中荷葉堿浸提動力學過程。

表4 不同溶劑量浸提動力學考察擬合方程（X=ln（M-R），Y=lnC）

圖5 不同溶劑體積浸提動力學擬合曲線[lnC-ln（M-R）]

表5 不同溶劑浸提荷葉堿濃度與時間考察 μg/mL

3 討論

基于Fick第一定律建立浸提動力學模型考察不同溫度、溶劑量、溶劑種類對荷葉堿浸提規律的影響。結果，溫度升高，浸提速率及浸提量提高。隨浸提體積增大，荷葉堿平衡提取量增大。不同濃度溶劑提取過程中，存在濃度交叉，以70%乙醇提取率最高。

圖6 不同溶劑浸提曲線

表6 不同溶劑浸提動力學考察擬合方程（ln[C∞/（C∞-C）]-t）

圖7 不同溶劑浸提動力學考察

本研究對不同溫度、溶劑量、溶劑中荷葉浸提動力學進行考察，基于Fick第一定律建立數學模型進行擬合與推測，不同溶劑中荷葉中荷葉堿浸提動力學符合一級一項浸提動力學模型。建立的中藥浸提動力學模型，相關性良好，能夠描述浸提溫度、溶劑種類、浸提體積對荷葉堿浸提動力學的影響，為荷葉實際生產中提供理論依據與數據支持。

目前研究內容為藥材中單一成分，后續應將所得荷葉浸提動力學模型應用于中藥復方的研究，為確定中藥復方的最佳提取條件提供參考與數據支持。