紅花黃色素對缺血性腦室周圍白質軟化新生鼠腦保護作用及機制研究*

李裴裴，彭金霞

（1.濮陽市中醫院藥劑科，濮陽 457000；2.湖北醫藥學院附屬人民醫院燒傷整形科，十堰 442000）

腦室周圍白質軟化（PVL）屬于早產兒腦損傷中較常見的一種類型，也是早產兒發生死亡或發育出現障礙的主要原因[1]。研究證實[2]，少突膠質細胞（OL）及其前體在早產兒PVL發病中起著非常關鍵的作用。早產兒腦白質對因缺血缺氧導致的損傷非常敏感，是早產兒發生PVL的重要原因，而氧化應激、相關凋亡蛋白表達水平變化在損傷及PVL形成中起著誘導的作用。迄今，PVL的治療仍無有效的方法，紅花黃色素是紅花花瓣中提取的一種天然黃色素，有研究表明[3]，其對抗血栓、降血脂、抗動脈粥樣硬化、擴張冠狀動脈方面效果顯著；也有研究顯示，其在大鼠腦缺血性疾病的治療中有一定的保護作用。但其在新生鼠腦損傷的影響研究較少，特別是對新生鼠腦室周圍白質軟化的作用及機制研究更少，因此，本研究以新生7日鼠為實驗對象，探討其對PVL新生鼠的腦保護作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 動物及分組 新生7日齡SD大鼠60只，清潔級，性別無要求，體質量12～17 g，由上海西普爾動物有限公司提供，許可證：SCXK（滬2013-0002），新生鼠均在室溫下母鼠喂養，濕度為60%～70%。將新生鼠根據數字表法進行分組：假手術組、模型組、陽性對照組、紅花組各15只。

1.2 儀器及試藥 倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司，型號：CX41-12C02）；全波長酶標儀、垂直電泳儀由Bio-Rad公司提供；石蠟切片機、包埋機（德國Leica公司提供）。恒溫冰凍切片機由德國Lecia公司提供。O4單抗體、髓鞘堿性蛋白（MBP）單抗體、縫隙連接蛋白（Cx47）、巢蛋白（Nestin）試劑盒由北京博奧森生物公司提供；山羊抗兔IgG由上海基金科技公司提供；SABC免疫組化試劑盒由北京中杉公司提供；谷胱甘肽過氧化酶（GPx）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）及過氧化物酶（CAT）由南京建成生物公司提供。

1.3 PVL（缺血型）模型制備及用藥 新生大鼠稱質量后用乙醚進行麻醉，取仰臥位固定，頸部皮膚消毒（75%乙醇），切口沿正中線皮膚，結扎（6.0號線）雙側頸總動脈，皮膚縫合后涂抹火棉膠后，放在母鼠身邊恢復至麻醉蘇醒2 h，再放置于濕度70%左右、溫度37℃的恒溫常壓缺氧箱中，并注入混合氣體（92%N2和 8%O2，流量 1～2.5 L/min）缺氧 30 min，然后將動物放回母鼠的身邊。假手術組游離兩側頸總動脈后不結扎直接進行縫合，不給予缺氧、用藥處理；其他組均建造新生鼠PVL模型，陽性對照組造模成功后立即給予重組促紅細胞生成素（rEPO）5 000 U/kg，紅花組造模成功后立即給予紅花黃色素3 mg/kg，模型組不給予用藥處理。48 h后處死新生鼠，完整取出腦組織由4%多聚甲醛固定待用。

1.4 病理檢測 腦組織標本將視交叉與乳頭體的中部作為切面進行腦冠狀切片，其厚度3～4 mm，用石蠟包埋切片后，蘇木精-伊紅（HE）染色，在光鏡下進行腦室周圍白質病理評估。根據Chen N[4]的評分標準，對白質損傷進行評價：正常為0度；神經纖維表現輕度異常（排列不整齊），白質表現輕度疏松，為Ⅰ度；神經纖維表現重度異常，形成凝固性壞死及囊腔，排列不整齊，白質表現嚴重疏松，為Ⅱ度。

1.5 免疫組化法 常規制作免疫組化法分析標本，將O4、MBP、Cx47、Nestin單抗工作液濃度均為1∶100，將磷酸鹽緩沖液（PBS）作為陰性對照。倒置顯微鏡（Olympus）下進行觀察，Image-Pro Plus5.0軟件對圖像進行分析。同一部位（腦室周圍）隨機抽取5個視野（200倍鏡下觀察），計算IOD值。

1.6 腦組織抗氧化、氧化物質檢測 大鼠處死后迅速將腦組織取出，以視交叉與乳頭體的中部作為切片進行冠狀切片，將其稱質量后以1∶10的體積比例加入勻漿液，勻漿后，根據標準試劑盒中的說明書進行操作，用分光光度法對SOD、CAT、GSH-Px、MDA及GSH的含量進行檢測。

1.7 細胞相關凋亡蛋白檢測 使用免疫印跡法對細 胞 凋 亡 相 關 蛋 白 Bax、Bcl-2、Caspase-9 及Caspase3活化片段進行檢測。提取組織蛋白質后，用二喹啉甲酸（BCA）對總蛋白量進行測定，根據標準曲線法對蛋白濃度進行計算，經蛋白質聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠濕法轉膜，分別用兔抗鼠Bax、Bcl-2、Caspase-9 及 Caspase3 多抗（1∶1 000）孵育并過夜，然后與山羊抗兔IgG（濃度為1∶5 000）反應，用增加化學發光進行顯色，在X線片下曝光顯影。圖像處理儀作灰度掃描分析。以β-Tublin為內參。

1.7 統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行分析。計量資料表示用均數±標準差（x±s），多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用q檢驗；等級資料用秩和檢驗，兩兩比較用秩和檢驗的Nemenyi法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠腦白質損傷病理情況 各組大鼠造模過程中及造模48 h內均無死亡，在用藥48 h后進行腦病理檢測，結果顯示，假手術組大鼠未發現病理改變（神經纖維走向整齊，排列致密），模型組大鼠腦室周圍白質及腦皮質下病理均明顯改變，組織疏松壞死，結構模糊，神經纖維呈網狀或條索狀，走向紊亂，部分可見有囊性空洞；陽性對照組及紅花組大鼠腦損傷情況與模型組比較，神經纖維排列紊亂情況及白質疏松情況均有明顯好轉，可見部分白質結構趨于正常。見圖1。陽性對照組、紅花組腦白質整體損傷程度明顯輕于模型組（P＜0.05）。見表1。

圖1 各組大鼠腦白質損傷病理情況（HE×200）

表1 各組大鼠腦白質損傷病理情況分析 例（%）

2.2 各組腦白質損傷標志物陽性表達情況 模型組大鼠O4（標記OL前體細胞）、MBP（標記成熟OL細胞）、CX47陽性細胞數明顯低于假手術組，Nestin陽性細胞數明顯高于假手術組（均達到P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組、紅花組O4、MBP、CX47及Nestin陽性細胞數均明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）；紅花組各項指標與陽性對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表 2、圖 2。

表2 各組腦白質損傷標志物陽性表達情況（x±s）IOD×103

圖2 各組大鼠免疫組化圖片（×200）

2.3 各組大鼠抗氧化、氧化物質指標情況分析 模型組大鼠GPx、SOD、CAT及GSH水平明顯低于假手術組，MDA水平明顯高于假手術組（均達到P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組、紅花組GPx、SOD、CAT及GSH水平均明顯升高，MDA水平明顯降低（均達到P＜0.05）；紅花組各項指標與陽性對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 各組大鼠抗氧化、氧化物質指標情況分析（x±s）

2.4 各組相關凋亡因子表達情況 與假手術組比較，模型組Bax表達明顯升高，Bcl-2表達明顯降低，Caspase-9及 Caspase-3激活均明顯增加（P＜0.05）。與模型組比較，陽性對照組及紅花組Bax表達明顯降低，Bcl2表達明顯升高，Cleaved Caspase-9及Cleaved Caspase-3激活均明顯降低（P＜0.05）。見圖3、圖 4。

圖3 各組相關凋亡因子表達情況

圖4 各組相關凋亡因子表達情況

3 討論

研究證實[5-6]，PVL是早產兒發生認識障礙或腦癱的主要原因之一。對PVL的治療目前仍無特有效的方法。紅花為臨床上常用的活血化瘀性藥物，其中主要成分包括黃酮醇類及查爾酮類，紅花黃色素則為查爾酮類的有效部位群，是紅花中有效成分（具有水溶性）的混合物，具有較強的抗氧化活性。研究證實，其抗氧化性與其分子中有多個酚羥基有關。多年來，其在抗動脈粥樣硬化、抗血栓、降血脂的治療中廣泛應用。廖金明[7]的研究顯示，其能夠清除體內自由基，阻滯脂質發生過氧化反應，從而發揮活血化瘀作用。歐芹[8]對衰老模型小鼠的腦細胞凋亡因子進行研究，結果發現，紅花黃色素使腦細胞凋亡率明顯降低。但這些研究均局限于對成人的研究，其對新生兒腦缺血缺氧損傷的保護作用研究臨床上還很少，對其作用機制尚不清楚，由此，設計本研究對臨床新生兒腦缺血性疾病的治療意義重大。

OL前體是引起腦白質損傷的重要靶細胞，常用O4標記OL前體，用MBP標記成熟的OL細胞；CX47則為縫隙連接蛋白的一種，特定性地表達于少突膠質細胞，并與髓鞘基因有平行調節作用，當CX47敲除后髓鞘化則無法正常進行；Nestin為中間絲蛋白的一種，正常情況下，成熟腦組織中的Nestin表達較少，當腦組織缺血缺氧時，其能夠促進中樞神經細胞再生及神經細胞原位增殖；同樣，正常腦白質區，nestin表達水平也很低，但出現損傷后則其表達有明顯升高，以促進神經干細胞再生[9]。本研究用石蠟病理切片、MBP、O4、CX47及Nestin表達對腦白質損傷情況進行評估，結果顯示，7日新生鼠在雙側頸總動脈結扎、缺氧處理后均能導致腦白質廣泛損傷，表現神經纖維紊亂排列、白質出現疏松，大量MBP、O4陽性OLs丟失，CX47表達降低，Nestin表達升高，由此證實缺血缺氧導致大鼠腦白質發生損傷，證實造模是成功的。但與模型組比較，陽性對照組、紅花組MBP、O4陽性細胞數均有明顯升高，CX47、Nestin陽性表達有明顯升高，由此說明，rEPO（在新生兒缺血缺氧腦病中應用廣泛，具有明顯的神經保護作用，能夠改善患兒近期及遠期的神經系統癥狀及認知功能[9]）及紅花黃色素均能改善腦白質損傷狀況，對腦白質損傷有一定的保護作用。但本研究只探討了紅花黃色素對缺血缺氧新生鼠腦白質損傷的短期保護作用，其對新生鼠缺血缺氧腦損傷是否有長期的效果及能否改善新生鼠缺血缺氧導致的行為缺陷，有待下一步進行研究。

研究證實[10]，缺血缺氧導致的白質損傷與體內的氧化應激關系密切。本研究結果顯示，新生鼠缺血缺氧后腦組織中的GPx、CAT、GSH水平明顯降低，而MDA水平明顯升高，提示腦缺血缺氧導致一系列活性氧簇（ROS）產生過多，從而引起氧化應激反應。而使用紅花黃色素及rEPO的紅花組及陽性對照組均能降低MDA水平，升高GPx、CAT、GSH水平，由此提示，紅花黃色素能夠減少腦缺血缺氧后發生氧化應激損傷，對缺血缺氧腦白質有保護作用。此結果與廖金明[11]的研究一致。本研究還對細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-9及Caspase3活化片段進行研究，結果顯示，紅花黃色素能夠抑制Caspase-9及Caspase3活化，并抑制Bax蛋白表達，同時提高Bcl-2表達，由此提示，紅花黃色素對缺血缺氧導致的腦白質損傷的保護作用可能與調節細胞凋亡相關因子的表達有關。

綜上所述，紅花黃色素對新生鼠缺血性腦室周圍白質軟化有保護作用，其作用機制不僅與調節抗氧化系統有關，還與調節細胞凋亡相關因子有關。