探究Eph受體A2在結直腸癌細胞化療耐藥中的作用及相關機制

洪鐘時 邱成志 王春曉 唐龍鋒 莊海濱 施澤生

福建醫科大學附屬第二醫院普通外科 (福建 泉州 362000)

腫瘤細胞的耐藥性主要為長期治療下的獲得性化療耐藥，此種棘手的關系與人Rph受體A2基因有著密切的相關性，針對結直腸癌腫瘤細胞耐藥的研究可以從人Rph受體A2基因入手，其對接示結直腸癌腫瘤細胞耐藥機制以及如何避免耐藥、優化化療方案等有重要意義[1-2]。為此，本文通過選擇選擇中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心提供的人結直腸癌細胞株、結腸耐藥細胞株進行實驗，旨在為臨床優化結直腸癌細胞化療方案、降低耐藥發生率提供實驗參考依據。具體報告如下。

1 對象和方法

1.1對象 選擇中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心提供且本實驗室自行傳代凍存的人結直腸癌細胞株、結腸耐藥細胞株。RPMI-1640 培養基(購自北京索萊寶科技有限公司)、Optu-MEM培養基(上海歌凡生物科技有限公司)。胎牛血清(購自Gibco公司。β-聯蛋白購自上海源葉生物科技有限公司。神經鈣黏素、波形蛋白(品牌：Gibco，產地：美國)。Notch、Snail 及 β-actin 抗體購自寶日醫生物技術北京有限公司。CCK-8 細胞活力及增殖檢測試劑盒購自美國Sigma公司。EphA2 siRNA 及其陰性對照 siRNA 購自上海研謹生物科技有限公司。倒置相差顯微鏡 購自Peprotech 公司。7500型實時熒光定量 PCR 儀購自上海研生實業有限公司。Matrigel、Transwell 小室均購自美國BD Biosciences公司。

1.2方法 本研究細胞總RNA抽提根據Trizol一步法進行操作。

(1)首先采用含有10.0%新生小牛血清RPMI-1640 培養基并將人結直腸癌細胞株、結腸耐藥細胞株置于37 ℃、5%CO2培養箱中進行培養。按照研究中的方法進行換液、胰酶傳代、Real-time PCR 檢測 mRNA 的表達(反向引物為 5’-TCAGACACCTTGCAGAC-CAG-3’；β-actin 作為內參照，正向引物為 5’-ACA-GAGCCTCGCCTTTGCCGATC-3’，反向引物為5’-ATCCTTCTGACCCATGCCCACCA-3’)、構建 PCR 反應體系、分析mRNA相對表達量。

(2)CCK-8法：加入不同濃度5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑、伊立替康檢測同步化已90%融合的人結直腸癌細胞株、結腸耐藥細胞株，統計其對化療藥物的敏感性(以半數抑制濃度IC50表示)。同時統計干擾EphA2的表達后統計人結腸耐藥細胞株對5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑的耐藥性。

(3)進行siRNA轉染，待人結直腸癌細胞株、結腸耐藥細胞株生長70%融合后同步化處理以及siRNA轉染。通過制作 Eph受體A2siRNA轉染組、空白組、siRNA陰性組，將其溶解Optu-MEM培養基。孵育后將三組轉染混合物加入人結直腸癌細胞株、結腸耐藥細胞株。對其放置細胞培養箱、正常培養基進行培養，提取細胞蛋白測定轉染效率進行分析。統計結直腸癌親本細胞株、結腸耐藥細胞株中 Eph受體A2siRNA表達水平，同時在結直腸癌親本細胞株中不斷提高5-FU濃度，統計 Eph受體A2siRNA表達。

(4)利用劃痕實驗、倒置相差顯微鏡觀察在干擾 Eph受體A2后人結直腸癌細胞株、結腸耐藥細胞株的自我修復。Transwell實驗觀察人結直腸癌細胞株、結腸耐藥細胞株染色后的數目(每組細胞包括3個視野，記錄其平均值)。

1.3統計學方法 人結直腸癌細胞株、結腸耐藥細胞株采用的所有數據均采用SPSS21.0軟件進行分析。半數抑制濃度IC50以Mean±SD表示，同時此類計量資料采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1結直腸癌耐藥細胞株、親本株化療耐藥性、交叉耐藥性分析 CCK-8法檢測結果得出結腸癌耐藥細胞株與親本細胞株的半數抑制濃度IC50，兩者相比較，結腸癌耐藥細胞株的半數抑制濃度優于親本株，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2Eph受體A2與結直腸癌細胞化療耐藥關系分析 結腸癌親本細胞株Eph受體A2蛋白表達水平(1.08±0.73)，結腸癌耐藥細胞株Eph受體A2蛋白表達水平(2.57±0.81)差異有統計學意義(t=6.843，P=0.000)。此外5-氟尿嘧啶0mg/L時親本細胞株中Eph受體A2蛋白表達水平為(0.9±0.5)，5-氟尿嘧啶5mg/L時Eph受體A2蛋白表達水平為(1.2±0.7)，10mg/L時Eph受體A2蛋白表達水平為(1.9±0.8)，呈逐漸增加的水平。這兩項研究結果提示Eph受體A2可調控結直腸癌細胞化療耐藥性。

表1 結直腸癌耐藥細胞株、親本株化療耐藥性、交叉耐藥性統計結果

2.3Eph受體A2干擾后對結直腸癌細胞的影響 低倍顯微鏡(1X00)可發現干擾Eph受體A2蛋白表達水平后細胞數量在6h、12h無明顯變化，而在48h細胞壁附著能力明顯下降。

3 討論

近年來，有諸多研究表明多種因子可介導Notch信號通路在腫瘤細胞增殖中發揮重要的調節作用，其包括Notch-1蛋白、人Rph受體A2基因等[3]。雖然臨床研究證實了人Rph受體A2基因與多種腫瘤病變的相關性，但關于探究Eph受體A2在結直腸癌細胞化療耐藥中的作用及相關機制的研究較少，這值得前瞻性研究深入調查[4]。

人Rph受體A2基因定位于1p36.1，有研究表明Eph基因家族是受體絡氨酸激酶中最大的亞族[5]。人Rph受體A2基因廣泛參與炎癥反應、腫瘤細胞增殖、腫瘤血管形成等病理生理過程，且在結直腸癌的病理生理過程中，人Rph受體A2基因對結直腸癌腫瘤細胞遷移、耐藥性增加和生長分化等諸多生理學過程發揮了重要作用，其表達水平與腫瘤造成的內外微環境有一定相關性[6-7]。有研究中通過人Rph受體A2基因沉默基因抑制Rph受體A2基因表達，然后觀察發現結腸癌細胞的增殖能力顯著降低，這證實了人Rph受體A2基因促使腫瘤細胞遷移等作用[8]。因此臨床研究認為人Rph受體A2基因通過介導Notch信號通路誘導腫瘤細胞增殖，并且內皮細胞衰老以及發揮促進腫瘤血管生成能力[9-10]。本次研究結果表明結腸癌耐藥細胞株中人Rph受體A2基因表達水平高于親本細胞株，且親本細胞株中人Rph受體A2基因隨著5-氟尿嘧啶劑量逐漸增加，其表達水平也明顯向升高，這表明人Rph受體A2基因具有促進結腸癌耐藥性增加的作用，這可能與人Rph受體A2基因介導Notch信號通路，促使腫瘤細胞獲得間充質樣特性，與此同時結腸癌腫瘤細胞也失去了上皮樣特性，此過程被稱為EMT，人Rph受體A2基因與其密切相關[11-12]。

綜上所述，人Rph受體A2基因可增加結直腸癌腫瘤細胞耐藥性，這可能與EMT有關。值得臨床重視。