循環腫瘤細胞檢測對評估頭頸部腫瘤療效及預后的研究進展

由 偉 王若雨，2*

1．遵義醫科大學(貴州 遵義 563099)；2.大連大學附屬中山醫院(遼寧 大連 116000)

頭頸部腫瘤是全球癌癥死亡率排名第六位的惡性腫瘤，全世界每年約65萬新發病例，大約導致35萬例患者死亡[1,2]。過去幾十年里，隨著影像學及治療手段不斷進步，目前形成了以手術、放療和化療聯合的綜合治療模式，該模式使腫瘤局部控制率顯著提高，但總生存率未見明顯提高，五年存活率仍約40%～50%[3-5]。由于患者早期癥狀不明顯及缺乏早期診斷及檢測手段，約三分之二的患者發現時已處于晚期，早期發現的患者即使經過積極的一線治療仍有約20%～30%發生局部復發或/和遠處轉移，遠處轉移是88%的患者死亡的主要原因[6]。因此如何能夠及時發現復發和轉移從而指導臨床個體化治療，最終使患者獲益尤為重要。頭頸部腫瘤由于其解剖結構的特殊性，各種形式的內窺鏡檢查和腫瘤組織活檢是診斷的金標準。這種侵入性檢查的缺點包括患者無法耐受多次組織活檢且價格昂貴；在難以取材的區域則可能無法明確診斷；樣本單一用于診斷疾病無法考慮腫瘤的異質性等[7]。因此急需方便且準確的檢查方法能夠在轉移灶出現之前識別具有轉移高風險的患者，從而提高個體化治療的能力。僅需抽取外周血即可獲得標本的液體活檢提供了一種可以以較少侵入性和簡單的方式跟蹤疾病狀態的方式，從而來確定疾病復發及進展。

液體活檢是指基于外周血中遺傳物質的腫瘤遺傳特征的分析，已用于監測實體腫瘤的治療效果以及追蹤耐藥機制[8]。這種非侵入性方法與傳統的組織活檢相比具有以下幾個優勢：獲取標本容易；允許多次取樣；微創；快捷；可能提供更全面的異質性疾病的復雜分子譜等[9]；血行轉移是腫瘤重要轉移方式之一，早在1869年病理學家Thomas Ashworth首次提出了轉移性腫瘤患者血液中存在循環腫瘤細胞(CTCs)[10]。循環腫瘤細胞是指外周血中來自腫瘤原發灶或轉移灶中的腫瘤細胞，在各種細胞因子的作用下進入血液及淋巴管循環，進入循環的腫瘤細胞僅有小部分會克服細胞凋亡、免疫系統消除、流體湍流而存活形成為轉移灶。作為一種非侵入性液體活檢的方法，已在轉移性乳腺癌、前列腺癌及結直腸癌中廣泛應用[11-13]，然而CTCs在頭頸部腫瘤中的價值目前尚不清楚，這方面研究相對較少且結論不一致。本文就在頭頸部腫瘤領域應用CTCs檢測這種工具的具體方法原理、可行性、臨床價值以及問題展望等方面做一個較為全面的綜述。

1 CTCs概述

CTCs分析過程包括分離、富集、檢測、計數和分子生物學分析。由于CTCs在外周血中十分罕見，十億個血細胞中可能只有一個CTCs且半衰期短，因此如何高效分離、富集CTCs對于整個CTCs的檢測過程舉足輕重。常用的分離、富集技術是利用CTCs不同特性將它們與血細胞分離，包括基于物理特性(大小、密度、電荷)、生物學特性(免疫磁性分離以及新興的微流控芯片技術)兩種方式。生物學特性分離富集主要有兩種選擇方式：陽性選擇和陰性選擇。陽性選擇是指利用特異性抗體與上皮細胞表面EpCAM抗原結合來捕獲CTCs；陰性選擇是指因白細胞表面存在標志蛋白CD45，但其不在CTCs表面表達，所以利用白細胞抗原CD45去除白細胞從而來分選CTCs。最后將樣本進行熒光掃描，系統會結合熒光染料試劑識別CTCs，將檢出CD45陰性、腫瘤特異性細胞核抗原DAPI陽性、角蛋白CK8、18、19陽性的細胞,判定為CTCs從而進一步行分子生物學分析。目前常用的分子表征檢測方法有免疫熒光法(IF)、免疫熒光雜交(FISH)、RT-PCR、二代測序(NGS)等[14,15]。CTCs的上皮間質轉化(EMT)過程是指CTCs通過下調上皮標志物和獲得間充質特性從而來增加遷徙及侵襲能力，導致細胞表型的顯著變化，由于EpCAM抗原并不在表達EMT的細胞中表達，而檢測CTCs的大多數系統都是基于上皮標志物EpCAM抗原的表達，因此在最近的一篇報道中認為CTCs的陰性選擇可能優于陽性選擇，因為它并不受細胞初始表面標記物的限制[16]。由于EMT的機制越來越被接受且在許多實體瘤的轉移中發揮作用，因此在尋找CTCs的有用檢測標記物時很少有研究開發出一種系統來富集和檢測沒有這些上皮標志物的CTCs，相反來使用表面標志物包括細胞質波形蛋白，N-鈣黏著蛋白，O-鈣粘蛋白，EGFR或腫瘤干細胞標記物CD44來檢測CTCs[17]。目前用于檢測CTCs的方法多種多樣，包括Oncoquick、ISET、MACS、Cell Search系統、CellCollector(r)、IFISH-CTC、RT-PCR、AdnaTest、CTC-chip等。雖然檢測CTCs的系統種類繁多，但很難將上述檢測技術進行比較，首先研究隊列本身差異很大，另外CTCs在循環中的半衰期一般不到24小時，因此血液收集和儲存的時間的不同也是比較不同技術時應該考慮的因素。迄今為止，CellSearch系統是唯一一個被美國食品和藥物管理總局(FDA)批準的自動化及標準化的CTCs檢測系統。該系統具有早期篩查、快速療效評估、輔助患者分期分級、監測耐藥情況、預測腫瘤轉移復發風險的作用，目前已被批準用于轉移性乳腺癌、前列腺癌、結直腸癌的療效監測及預后評估[18-20]，但在頭頸部腫瘤領域目前尚未獲得批準。

2 CTCs在頭頸部腫瘤的應用

2.1CTCs在頭頸部腫瘤的檢測可行性

Cell Search系統可以在多種腫瘤中檢測出CTCs，包括乳腺癌、前列腺癌、結直腸癌、肺癌、腎癌、膀胱癌、黑色素瘤、胃癌等。Bozec等人發現在晚期頭頸部腫瘤患者中有3/9(33%)和8/49(16%)例分別檢測到了CTCs[2]。Nichols等發現在6/15(40%)例頭頸部腫瘤患者檢測到了CTCs[21]。以上結果表明在頭頸部腫瘤中可檢測出CTCs。

2.2CTCs在頭頸部腫瘤中的臨床價值

目前已有多篇研究表明CTCs與臨床特征的相關性，既往研究表明CTCs水平與年齡、性別、病理類型、部位、腫瘤分期、腫瘤負荷、T/N分期等病理特征參數無關，然而近年來結論不一。在Buglione等人的研究中表明IV期以及腫瘤高負荷的患者外周血中更易檢出CTCs(16%對比6%)[22]。該結論同樣在Guney等人的研究中得到證實，Guney等人在21例剛確診未經診治的頭頸部腫瘤患者中檢出7例CTCs，同樣發現分期越晚越易檢出CTCs[23]。在He等人的研究中表明N2-3期患者更容易發現CTCs[24]，這與Hristozova等人的研究結果相似，其表明N2b期的患者更易發現CTCs，與T分期及腫瘤負荷無關[25]。而在Buglione等人觀察到在某些部位更易發現CTCs，口咽、下咽和鼻竇部的發現概率為5/39(13%),2/5(40%),3/6(50%)，然而在口腔癌(0/3)及鼻咽癌(0/10)患者中未發現CTCs，表明口咽部、下咽部及鼻竇部區域具有更高的表達上皮標記物的能力[22]。雖然在頭頸部腫瘤中關于檢測CTCs方面的研究不多，但上述研究結論與之前的研究結果明顯出現不一致。不僅在血行轉移中，在淋巴結轉移中同樣出現CTCs的身影，Hristozova等人表明CTCs與區域性淋巴結轉移具有相關性[25]。上述結果雖因納入患者樣本量例數及入組條件不一致，這可能導致相關結論不一致，但隨著檢測手段不斷提高，其結論均表明頭頸部腫瘤中CTCs與臨床病理特征之間可能具有相關性。

CTCs檢測在頭頸部腫瘤中評估療效及預后方面的作用還在研究過程中，目前有限的研究表明CTCs在評估頭頸部腫瘤預后方面可能具有一定作用。在Jatana等人研究發現CTCs與無病生存期(DFS)相關，檢測出較高數量CTCs的患者預后不良[3]。同樣在Guney等人的研究中表明檢測到CTCs患者更易復發轉移[23]。Wang等人在一篇包含433名患者的8項研究進行薈萃分析表明，CTCs陽性組其腫瘤更易進展[26]。Tinhofer等人研究表明口咽癌患者中CTCs與無病生存期(DFS)及總生存期(OS)相關，表明在口咽癌患者中CTCs存在標志著預后不良[27]。并且除基線CTCs可以提供預后信息以外，治療過程中CTCs數量的變化還可以提供額外信息，若治療中的CTCs持續存在則可以早期識別對治療無反應的腫瘤，從而及時更換治療方案。CTCs數量與治療反應之間的相關性在頭頸部腫瘤中相關研究較少，因此有必要進行大樣本的前瞻性臨床研究從而進一步探索CTCs檢測在頭頸部腫瘤中監測療效及評估預后的臨床價值。

3 問題及展望

CTCs檢測在頭頸部腫瘤早期診斷、療效監測及判斷預后的價值的研究一直進行的如火如荼，但多項研究均并未取得一致結果，從而并未在臨床上大范圍應用。原因可能有以下幾個方面：(1)頭頸部腫瘤由于解剖起源位點的不同生物學和臨床特征，因此導致既往各研究對象均是小患者隊列、不同的患者群體，導致研究結果可能不一致；(2)納入研究課題樣本量較少影響研究結果；(3)由于頭頸部腫瘤患者的異質性，頭頸部腫瘤包含5種不同的亞型并且其轉移潛能根據腫瘤起源的解剖部位而變化，因此導致結果的不一致性；(4)目前并無用于檢測CTCs的標準方法。因此對于頭頸部腫瘤患者，未來研究需要使用不同臨床亞型的大規模患者群體、標準化的CTCs檢測方法進行全面研究，從而明確CTCs檢測在頭頸腫瘤患者中的臨床意義，以期為臨床篩選潛在的預測療效和判斷預后的標志物提供理論依據，有助于患者的臨床管理和個體化治療，最終使患者獲益。