穿心蓮超聲提取工藝研究

周汝順，江燕，陳啟友，李裕

(湖南省獸藥飼料監察所，長沙 410006)

穿心蓮是爵床科穿心蓮屬植物，又名欖核蓮、一見喜，為一年生草本植物。藥用穿心蓮為植物穿心蓮 [Andrographispaniculata(Burm.f.)Nees]的干燥地上部分，具有清熱解毒，消腫止痛的功效[1]。穿心蓮中的成分復雜，已從中分離出多種二萜內酯類、黃酮類以及其他成分[2]。其中二萜內酯類成分是其用于治療急性痢疾、胃腸炎、咽喉炎、扁桃體炎、感冒發熱等的有效成分，但由于穿心蓮內酯等二萜內酯類成分水溶性較差且遇熱不穩定[3-4]，在傳統生產提取過程中易被破壞，提取率低，因此本文通過試驗旨在探索超聲提取最佳生產工藝，為穿心蓮有效成分的提取提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 Agilent 1200高效液相色譜儀(含四元梯度泵，紫外檢測器，自動進樣器，柱溫箱，色譜工作站)，梅特勒MS205DU電子天平，QYTC型臺式超聲波清洗機，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純；穿心蓮內酯(批號110797-200307，來源中國藥品生物制品檢定所)，脫水穿心蓮內酯(批號110854-201308，含量99.7%，來源中國食品藥品鑒定研究院)，新穿心蓮內酯(批號B21392，含量≥98%，來源上海源葉生物科技有限公司)。穿心蓮藥材及穿心蓮葉和莖均由湖南綠亨世源動物藥業有限公司提供，產于廣西貴港。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件與系統適應性試驗 Agilent TC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 um)，流動相：乙腈-水(38∶62)，流速：1.0 mL/min，柱溫25 ℃，進樣量：10 μL，檢測波長：穿心蓮內酯為225 nm，新穿心蓮內酯為210 nm，脫水穿心蓮內酯為254 nm；理論塔板數按穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯和新穿心蓮內酯峰計算均應不低于2000。

1.2.2 對照品溶液的制備 取穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯和新穿心蓮內酯適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL各含0.1 mg的混合溶液，即得。

1.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取本品10 g，按不同的提取方法提取后制成100 mL提取液。取5 mL過中性氧化鋁柱，用50%乙醇定容至100 mL，搖勻，即得。

圖1 對照品液相色譜圖(1為穿心蓮內酯峰，2為新穿心蓮內酯峰，3為脫水穿心蓮內酯峰)Fig 1 HPLC chromatogram of reference substance(1 is andrographolide peak, 2 is Neoandrographolide peak,3 is dehydroandrographolide peak)

1.2.4 單因素實驗設計 分別考察不同提取方法，不同乙醇濃度，不同料液比，不同超聲時間，不同藥用部位等因素對穿心蓮二萜內酯類成分總含量(穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯和新穿心蓮內酯的總和)的影響。

1.2.5 正交試驗設計 在單因素研究的基礎上，以二萜內酯類成分總含量為測定指標，對影響提取工藝的主要因素(A乙醇含量、B提取時間、C料液比)設計正交試驗，優化超聲提取穿心蓮中二萜內酯類成分的最佳工藝條件。

1.2.6 數據處理 分析所有的樣品均采用隨機取樣的方法，所有實驗數據均為兩次測定的平均值，并計算標準偏差。采用EXCEL進行作圖。正交試驗數據統計分析采用SPSS18.0數據處理軟件。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取方法的選擇 準確稱取穿心蓮10 g,加60%乙醇100 mL做提取液，分別用浸漬24 h、50℃熱浸6 h、超聲1 h、加熱回流1 h及水煎煮2 h的方法提取，計算不同提取方法下二萜內酯類總含量，結果見圖2。

圖2 不同提取方法提取二萜內酯類總含量的比較Fig 2 Comparison of total diterpene lactonesextracted by different extraction methods

從圖2可知，不同方法提取二萜內酯類總含量以超聲工藝>浸漬工藝>溫浸工藝>回流工藝。超聲提取的得率略高，但四者的差異不顯著，考慮到超聲提取的快捷性和工藝提取的可操作性，超聲提取最合適。

2.1.2 乙醇濃度的選擇 準確稱取穿心蓮10g,分別用100 mL30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90乙醇、無水乙醇浸泡1 h后超聲提取1 h，計算不同乙醇濃度下提取二萜內酯類總含量，結果見圖3。

圖3 不同乙醇濃度提取二萜內酯類總含量的比較Fig 3 Comparison of total diterpene lactones extractedwith different ethanol concentrations

從圖3可知，隨著乙醇濃度的增加，二萜內酯類含量逐漸增大，60%濃度時達到最高，而后含量稍有下降，但維持在一個穩定的水平。因此選擇60%乙醇作為提取溶劑。

2.1.3 提取時間的選擇 準確稱取穿心蓮10 g,分別用100 mL 60%乙醇浸泡1 h后超聲提取30 min，1、1.5、2、3 h，計算不同超聲時間下提取二萜類總含量，結果見圖4。

圖4 不同超聲時間提取二萜內酯類總含量的比較Fig 4 Comparison of total diterpene lactonesextracted at different ultrasonic times

從圖4可知，隨著提取時間的延長，二萜類總含量逐漸增大，在1 h后增長放緩，考慮到提取工藝的經濟性和高效性，選擇超聲提取時間1 h。

2.1.4 料液比的選擇 準確稱取穿心蓮10 g,分別用50、100、200、300 mL60%乙醇超聲提取1 h，計算不同料液比下二萜內酯類總含量，結果見圖5。

圖5 不同料液比提取二萜內酯類總含量的比較Fig 5 Comparison of total content of diterpene lactonesextracted by different solid-liquid ratios

從圖5可知，隨著料液比的增大，二萜類總含量逐漸增大，在1∶10后增長放緩，考慮到提取工藝的經濟性和高效性，選擇料液比為1∶10。

2.1.5 不同藥用部位對二萜內酯總含量的影響

準確稱取穿心蓮葉、穿心蓮莖、穿心蓮藥材(葉不少于30%)各10 g，加100 mL60%乙醇超聲提取1 h，計算不同藥材部位下二萜類總含量，結果見圖6。

圖6 不同藥用部位提取二萜內酯類總含量的比較Fig 6 Comparison of total content of diterpene lactonesextracted from different medicinal parts

2.2 正交試驗優選提取工藝參數

2.2.1 正交試驗供試品制備及測定 根據單因素試驗確定的提取條件，對影響提取工藝的主要因素(A乙醇含量、B提取時間、C料液比)按3因素3水平進行L9(33)正交試驗[11-12](見表1)。

表1 正交試驗考察因素與水平Tab 1 Factor and level of orthogonal test

2.2.2 正交試驗結果 對正交試驗樣品測得結果，采用SPSS 18.0統計軟件進行直觀分析及方差分析，結果見表2，表3。

表2 L9(3*3)正交試驗結果Tab 2 The results of Orthogonal test

表3 方差分析表Tab 3 The table of Variance analysis

從上表可知，影響穿心蓮二萜內酯類總含量的各因素主次關系為A>C>B,即乙醇濃度>料液比>超聲時間。經過方差分析，乙醇濃度對總含量有顯著影響，超聲時間和料液比對總含量的影響不顯著。由此可得最佳提取工藝為A3B2C2，即乙醇濃度60%，超聲時間1 h，料液比為1∶15下提取率最高。

2.2.3 驗證試驗 按優選的最佳提取工藝進行試驗，即乙醇濃度60%，超聲時間1 h，料液比1∶15，測定穿心蓮二萜類總含量，結果見表4。

表4 驗證試驗結果Tab 4 The results of validation test

3 討論與結論

3.1 質量控制方法的選擇 穿心蓮含多種二萜內酯類成分，主要有穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯、新穿心蓮內酯和去氧穿心蓮內酯等4種。穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯是目前穿心蓮藥材及相關產品的質量控制成分[5]，有文獻報道新穿心蓮內酯有較好的藥理活性[6-8]。參照路新華[9]的研究，因此本試驗通過測定穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯和新穿心蓮內酯三種二萜內酯類成分的總含量來評價和控制穿心蓮藥材的質量，保證其療效。本試驗通過切換波長法同時測定上述三種二萜內酯類成分，穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯和新穿心蓮內酯經紫外分光光度計掃描分別在225、254、203 nm處有最大吸收，考慮到203 nm為近紫外區，干擾較大，基線不穩定，因此選取210 nm作為新穿心蓮內酯的檢測波長。

3.2 超聲提取方法的選擇 不同方法提取二萜內酯類總含量以超聲工藝>浸漬工藝>溫浸工藝>回流工藝，這與張建強的研究基本一致[4]。而水煎煮法提取的二萜內酯類總含量明顯低于醇提法，這主要是因為穿心蓮中的成份具有熱不穩定性，上述二萜內酯類成分水溶性較差且遇熱不穩定。根據聶凌云等[3]的研究表明，短時間內加熱對內酯類穩定性影響不大，溫度升高至85 ℃, 穿心蓮內酯含量隨加熱時間增加而下降明顯，脫水穿心蓮內酯含量會略有提高，但兩者之和也呈下降趨勢。長時間加熱會導致內酯環的結構破壞, 從而使兩者含量的總和下降，這說明穿心蓮二萜內酯類成分受熱不穩定，不適宜用加熱提取的方法。

根據不同藥用部位提取的二萜類總含量結果顯示，穿心蓮莖和葉中穿心蓮內酯類成分含量相差很大，莖中總含量不到葉中三分之一,這與陳敏武的研究一致[10]。穿心蓮藥材根據葉含量的不同，價格各不相同，據調查，市場上穿心蓮葉和莖大多分開銷售，只有極少數是一起銷售的。所以《中國獸藥典》中規定穿心蓮藥材中葉的含量不得低于30%是有必要的。一些以穿心蓮為原料藥的制劑應加大葉的投料比例，以提高療效和產品質量。

3.3 結論 本文以乙醇濃度，提取時間，料液比3個因素，應用超聲波提取法進行單因素試驗及正交試驗，得到最佳提取條件：即乙醇濃度為60%，提取時間1 h，料液比為1∶15。在該條件下穿心蓮二萜內酯總含量為2.27，RSD值為1.3%。本研究所優化的提取工藝簡便，穩定，可行，提取率高，可為穿心蓮有效成分的提取提供理論依據。