鐵皮石斛組織培養研究

楊慧仙

(山西沃成生態環境研究所，山西 太原 030006)

鐵皮石斛，蘭科石斛屬，為多年生草本植物(附生)，最適生長環境具有濕潤、涼爽、空氣暢通的特點，主要生長于海拔1 600 m的山地半陰濕的巖石上，喜溫暖濕潤氣候和半陰半陽的環境，不耐寒。鐵皮石斛是一種珍貴的中藥材，具有滋養陰津、促進消化、提高免疫力，抗疲勞抗氧化，對腸胃病、咽喉疾病、糖尿病、心腦血管病等都有顯著療效[1]。但是鐵皮石斛因其本身的種質特點(種子小而無胚乳)，于天然狀態下發芽率極低，而在與真菌共生時萌發率較高[2]，并且生長發育緩慢。近年來，隨著自然環境的嚴重破壞、氣候變化和人為過度開采導致原生地鐵皮石斛已瀕臨滅絕。鐵皮石斛為享譽國際的“藥界大熊貓”，早在1987年就已成為三級保護植物(《國家重點保護野生藥材物種名錄》)，且于1992年作為瀕危植物，被錄入《中國植物紅皮書：稀有瀕危植物》[3]，目前，鐵皮石斛已成為世界自然保護聯盟認定的極度瀕危植物[4]。植物組織培養技術是實現植物快速繁殖，人工栽培最快的技術手段[5]。鑒于野生的鐵皮石斛非常稀少而且非常昂貴，不適合大眾消費，因此，組織培養技術作為鐵皮石斛擴繁的關鍵，已成為解決其資源短缺的最有效途徑。為了提高鐵皮石斛的繁殖系數，本文以幼嫩的鐵皮石斛帶節莖段為試驗材料，探究不同激素濃度、配比及添加不同種類的植物營養液對鐵皮石斛組織培養的影響，以期找到適合鐵皮石斛擴繁的最佳培養基配方，以達快繁和工廠化育苗的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鐵皮石斛健壯實生苗由山西長治易康園鐵皮石斛養殖基地提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的消毒 于生長旺盛、無病害、粗壯的植株上剪取中間莖段(4～8 cm)，肥皂水洗凈后剝去莖表皮，流水沖洗1 h后放入超凈工作臺。依次進行如下步驟：70%酒精消毒(30 s)，無菌水清洗(3次)，0.1%升汞浸泡(3 min，中間搖晃5次)；無菌水沖洗5次；無菌濾紙吸干帶芽莖段的表面水分，剪成1.5 cm左右小段后放入無菌培養皿中備用。

1.2.2 誘導培養基的篩選 本試驗選取6種誘導培養基進行試驗，調節pH為5.8～6.2。培養基配制如下：

(1)MS+6-BA0.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+蔗糖30g·L-1

(2)MS+6-BA0.5 mg·L-1+NAA1.0 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1

(3)MS+6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1

(4)MS+6-BA1.0 mg·L-1+NAA1.0 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1

(5)MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1

(6)MS+6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1

每種培養基接20瓶，每瓶接5個莖段。放入培養室(溫度25 ℃±2，光照12 h，光照強度為2 000 lx)，以45 d后外植體的生長狀況作為結果進行統計記錄。

1.2.3 繼代培養基的篩選 新芽長成之后，剪成大小均一的帶芽莖段(1.5 cm左右)，轉接至繼代培養基中培養。本試驗共設置了4種繼代培養基，調節pH為5.8～6.2。培養基配制如下：

(1)MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+香蕉汁30 g·L-1+蔗糖30 g·L-1

(2)MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+香蕉汁30 g·L-1+ 活性炭1 g·L-1+蔗糖30 g·L-1

(3)MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+馬鈴薯汁100 g·L-1+蔗糖30 g·L-1

(4)MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+馬鈴薯汁100 g·L-1+ 活性炭1 g·L-1+蔗糖30 g·L-1

每個處理接20瓶，每瓶接5個莖段。放入培養室(溫度25 ℃±2，光照12 h，光照強度為2 000 lx)，觀察記錄，45 d后統計生長狀況。

1.2.4 生根培養基的篩選 選取一定高度(>1.5 cm)且生長健壯的幼苗，于生根培養基上培養，培養基的pH調至5.8～6.2。本試驗生根培養基設五個處理，分別為：

(1)1/2MS+NAA0.1 mg·L-1+香蕉汁30 g·L-1+蔗糖30 g·L-1

(2)1/2MS+NAA0.2 mg·L-1+香蕉汁30 g·L-1+蔗糖30 g·L-1

(3)1/2MS+NAA0.3 mg·L-1+香蕉汁30 g·L-1+蔗糖30 g·L-1

(4)1/2MS+NAA0.4 mg·L-1+香蕉汁30 g·L-1+蔗糖30 g·L-1

(5)1/2MS+NAA0.5 mg·L-1+香蕉汁30 g·L-1+蔗糖30 g·L-1

每個處理接20瓶，每瓶接5個莖段。放入培養室(溫度25 ℃±2，光照12 h, 光照強度為2 000 lx)，觀察記錄生根情況，45 d后統計生根率。

2 結果與分析

2.1 不同激素處理對鐵皮石斛嫩莖誘導的影響

如表1所示，不同生長激素的濃度及配比在誘導鐵皮石斛嫩莖的發生方面影響顯著。選擇0.5 mg·L-16-BA時，鐵皮石斛生長緩慢，出芽少且部分苗形成愈傷組織。鐵皮石斛小苗隨6-BA濃度的升高而萌動加快且出芽增多。研究發現，6-BA(1.5 mg·L-1)與NAA(0.5 mg·L-1)結合使用時誘導效果最好(誘導率達到97%)，且鐵皮石斛出芽最多、生長茁壯。因此本試驗中鐵皮石斛的嫩莖誘導的最佳培養基為MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1。

表1 不同激素處理對鐵皮石斛嫩莖誘導的影響

2.2 不同培養基對鐵皮石斛繼代培養的影響

從表2可知：鐵皮石斛組培苗在加入活性炭的培養基中的長勢整體比不加活性炭的好，且增殖系數較大；培養基中添加了30g/L香蕉汁的鐵皮石斛組培苗比添加了100 g·L-1馬鈴薯汁的出芽少，即增殖系數較小，但苗長得較壯；而在添加了馬鈴薯汁的培養基中出芽多即增殖系數大，但是苗細長、葉窄。試驗結果表明，香蕉汁的壯苗效果優于馬鈴薯汁，而馬鈴薯汁的增殖效果明顯好于香蕉汁。因此，在對鐵皮石斛進行繼代培養時，前期可以用培養基MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+馬鈴薯汁100 g·L-1+ 活性炭1 g·L-1+蔗糖30 g·L-1，獲得較多的芽，后期將長勢較弱的苗轉接入培養基MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+香蕉汁30 g·L-1+ 活性炭1 g·L-1+蔗糖30 g·L-1，使苗長得更粗壯。

表2 不同培養基對鐵皮石斛繼代培養的影響

2.3 不同培養基對鐵皮石斛生根培養的影響

在生根培養基中，不同濃度的NAA對鐵皮石斛根的誘導效果明顯。如表3所示，鐵皮石斛生根率隨NAA濃度的升高，呈現出先升后降的變化趨勢。0.3 mg·L-1NAA處理時，鐵皮石斛的生根率最高(達到94%)，且此時培養基中的組培苗長勢良好(莖粗壯、主根長而粗、側根多而壯)。這可能是因為低濃度的NAA，促進鐵皮石斛的生根，高濃度的NAA，抑制鐵皮石斛生根。因此，本試驗中最適合鐵皮石斛生根的培養基為：1/2MS+NAA0.3 mg·L-1+香蕉汁30 g·L-1+蔗糖30 g·L-1。

表3 不同培養基對鐵皮石斛繼代培養的影響

3 結論與討論

試驗結果表明，鐵皮石斛嫩莖的最佳誘導培養基為：MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1。繼代培養基可以用MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+馬鈴薯汁100 g·L-1+ 活性炭1 g·L-1+蔗糖30 g·L-1，獲得較多的鐵皮石斛芽，再將獲得的芽轉接入MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1蕉汁30 g·L-1+活性炭1 g·L-1+蔗糖30 g·L-1，使鐵皮石斛苗長得更粗壯。最佳的生根培養基是：1/2MS+NAA0.3 mg·L-1+香蕉汁30 g·L-1+蔗糖30 g·L-1。

本試驗在培養基中加入了香蕉汁、馬鈴薯汁以及活性炭，這些物質能夠為外植體提供一些必要的微量營養成分、生理活性物質和生長激素等，對鐵皮石斛的增殖和分化有促進作用。香蕉汁的壯苗效果優于馬鈴薯汁，而馬鈴薯汁的增殖效果明顯好于香蕉汁，這和郜李彬等[6]人的研究結果一致。前人在鐵皮石斛培養的不同階段也曾加入了不同的天然提取液，得到的結果也不盡相同。這可能跟不同的研究人員選取的鐵皮石斛品種、外植體類型不同有關。因此要根據具體的品種、外植體類型等實際情況選擇鐵皮石斛組織培養的培養基配方。