中藥川楝子炮制前后總三萜的含量變化研究

崔乃華，夏林波，唐爽，段新新，鄧仕任

(遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 116600)

川楝子(MeliatoosendanSieb.)，又名金鈴子，為楝科植物楝(MeliatoosendanSieb.et Zucc.)的干燥成熟果實[1]，具有疏肝瀉熱、殺蟲[2]、止痛[3]的功效。《中國藥典》2015年版收錄了川楝子生品和炒品[4]。川楝子生品有小毒，現代藥理研究表明其具有肌無力、抑制呼吸中樞等毒副作用[5]，故常將其炮制后入藥[6]，以達到“減毒增效”作用[7-8]。川楝素是目前公認的川楝子中的特征毒性成分，當前的炮制減毒研究多從川楝素的含量變化著手，而尚未見炮制對三萜類成分的整體含量變化的相關研究[9-12]。現已知，藥的藥效是多種成分共同作用實現的[13]，僅以川楝素這一種三萜成分含量變化作為其炮制機制的研究指標，顯然是不全面、不充分的。本試驗對川楝子炮制前后的總三萜含量變化進行研究，以期對為川楝子的炮制減毒機制進行較為全面的評價。

1 試驗材料

1.1 試驗藥品 川楝子飲片購于河北省安國市中藥材市場，經遼寧中醫藥大學鑒定教研室王榮祥教授鑒定為楝科植物川楝(MeliatoosendanSieb.et Zucc.)的干燥成熟果實。川楝素對照品(四川省維克奇生物科技有限公司，批號：130320)。甲醇、高氯酸、冰乙酸、香草醛均為分析純。

1.2 試驗儀器 FA1004B型精密電子天平(上海精密科學儀表有限公司)； DFT-100型高速萬能粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)；ZDHW型電熱套(北京市永光明醫療儀器廠)。UV-1240型紫外可見分光光度計(日本島津)；HH-4數顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；DHG202-0型電熱恒溫干燥箱。

2 試驗方法與結果

2.1 對照品溶液制備 精密稱取川楝素對照品10 mg，精密加入10 mL甲醇溶劑，制成1 mg·mL-1的川楝素對照品溶液備用。

2.2 供試品溶液制備 精密稱定本品粉末0.5 g于圓底燒瓶中，再精密加入甲醇25 mL，渦旋混勻后稱定重量，加熱回流1 h，冷卻至室溫后稱定重量，用甲醇溶劑補足損失的重量，搖勻，抽濾，即得。

2.3 川楝子炮制品制備 嚴格按照《中國藥典》2015年版中，炒川楝子項下的炮制方法進行。平行炒制3份，分別命名為炮制品1、炮制品2、炮制品3。

2.4 測定波長及顯色條件 精密吸取50 μL川楝素對照品甲醇溶液置于具塞試管中，水浴蒸干甲醇溶劑，精密加入0.8 mL高氯酸穩定劑和0.2 mL 5%香草醛-冰乙酸顯色劑，在60 ℃水浴中加熱15 min后，立即移入冰水浴，精密加入5 mL冰乙酸搖勻后置于室溫。取相應的空白試劑校正基線后，于200～600 nm波長范圍內進行全波長掃描，在515 nm處顯示最大吸收峰，所以樣品的測定波長選擇515 nm。

2.5 線性關系考察 分別精密量取5份川楝素對照品溶液20、40、60、80、100 μL，按“2.4”項下顯色方法進行顯色后，以空白試劑校正基線，在波長515 nm下分別測定吸光度，以吸光度Y對絕對量X(μg)繪制標準曲線，回歸方程為Y=0.006 4X-0.001 2，R2=0.999 8；表明川楝素在20～100 μg范圍內與吸光度具有良好的線性關系。

2.6 精密度試驗 精密取川楝子生品供試品溶液300 μL，按“2.4”項下顯色方法進行顯色后，在上述條件下連續測定6次，分別記錄吸光度值，吸光度平均值為0.353 0，RSD為1.64%，表明本法精密度良好，結果見表1。

表1 精密度試驗結果

2.7 重復性試驗 分別精密量取川楝子生品粉末6份，每份0.5 g,按“2.2”項下的方法分別制備供試品溶液，按“2.4”項下顯色方法進行顯色后，分別測定吸光度，計算總三萜含量平均值為9.223 mg·g-1，RSD為0.54%，表明此法重復性良好，結果見表2。

表2 重復性試驗結果

2.8 穩定性試驗 取川楝子生品供試品溶液300 μL，按“2.4”項下顯色方法進行顯色后，置于室溫，分別在0、2、4、8、12、24 h測定各自吸光度，平均吸光度為0.358 0，RSD為1.87%，數據表明此供試品溶液在24 h內具有較好的穩定性，結果見表3。

2.9 加樣回收率試驗 取已知含量的川楝子生品(9.223 mg·g-1)9份，每份大約0.25 g，精密稱定。置具塞錐形瓶中，每組精密加入低、中、高濃度的川楝素對照品溶液，按“2.2”項下的方法以制備供試品溶液，在上述顯色條件下分析測定，結果表明該平均加樣回收率為99.8%，RSD=0.94%(n=9)，結果見表4。

表3 穩定性試驗結果

表4 加樣回收率試驗結果

2.10 樣品含量測定 分別稱取生品和不同炮制品粉末各約0.5 g，分別按“2.2”項下的方法制備供試品溶液后，在上述顯色條件下分析，計算每個樣品中總三萜的含量，結果如表5所示。

表5 川楝子各樣品總三萜含量

3 討論與總結

3.1 川楝子主產于我國南方各地，以四川省質量最佳，為四川省道地藥材[14]。川楝子中主要活性成分川楝素具有驅蟲、抗肉毒作用，明代之后對川楝子的毒性均認為有小毒[15]，是傳統的理氣中藥，關于川楝子的炮制方法，最早可追溯到南北朝時期的《雷公炮炙論》[16]所記述的酒蒸法，并提出“使肉既不使核，使核既不使肉”。宋至清代是川楝子炮制發展的鼎盛時期，發展了炒制、醋煮、酒浸、童子便浸、鹽炙、等炮制方法，近代在又新增了砂燙、烘制等方法，現行《中國藥典》2015年版收錄的是清炒法,川楝子經炮制后鎮痛作用增強顯著[17]，多炮制后使用，現代臨床上主要用來治療心痛、胸腹肋痛等。

3.2 總三萜的含量測定多采取顯色法來進行。在顯色過程中，文獻中大多采用熊果酸[18]作為對照品。本試驗發現，當采用熊果酸時，對照品顯色后的最大吸收波長位于545 nm，而川楝子樣品的最大吸收波長位于514～517 nm之間，上述結果表明熊果酸不適用于川楝子藥材的總三萜含量測定，其原因可能在于川楝子中的三萜成分多為呋喃三萜類化合物，其結構與熊果酸差異較大，因此顯色波長不同。基于上述考慮，我們嘗試將對照品改為同為呋喃三萜結構的川楝素后，發現對照品最大吸收波長藍移至515 nm，與實際樣品吻合度較好，故最終采用川楝素作為對照品。

3.3 本文首次報道川楝子中總三萜含量測定方法以及川楝子生品和炮制品中總三萜含量變化。采用UV法[19]測定川楝子總三萜含量對精密度要求很高，試驗操作過程要保證取樣量以及顯色劑的加入量必須精密準確，否則試驗結果重復性較差。通過方法學考察表明，本方法線性關系良好，重復性和穩定性較好，可用于川楝子總三萜含量測定。