加替沙星眼用溫敏凝膠流變學特性和體外釋放研究

孫銅，徐偉娜，冷佳蔚，李永貴

(1.山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250101；2.山東省藥學科學院，山東省醫用高分子材料重點實驗室，山東 濟南 250101)

加替沙星(Gatifloxacin，GTX)是第四代6-氟-8-甲氧基喹諾酮類抗菌藥物，它對革蘭陰性菌、革蘭陽性菌、衣原體、支原體、厭氧菌等有較好的抗菌作用，而且幾乎無潛在的光敏副反應。0.3%加替沙星滴眼液于2004年3月獲美國食品藥品監督管理局(FDA)批準，主要用于細菌性結膜炎的治療[1-2]。但是眼部給藥劑型發揮作用有以下幾點需要克服：首先，眼部給藥輔料及藥物不能對眼睛造成損傷，對眼部必須無刺激；其次，由于眼睛容量小，劑量損失較大，1滴滴眼液的平均劑量約為40 μL，進入眼部后，經淚液流失溢出后，恢復至正常淚液體積約為7 μL，這導致藥物在眼部的滯留時間短，生物利用度低[3]。

眼用原位凝膠，是一種以溶液狀態給藥，用藥部位在生理條件(包括溫度、pH值和離子)下，制劑中的高分子聚合物對環境刺激作出響應而發生相變，形成半固體凝膠狀態的給藥系統[4-7]。該系統具備一定的生物黏附性，可根據需要調整藥物的滯留與釋放，促進藥物的吸收，制備簡單，使用方便。有文獻表明，溫敏原位凝膠多次給藥對兔眼刺激性小，沒有對角膜造成損害，泊洛沙姆對組織無明顯損傷，刺激性小，生物相容性好，是常用的溫度敏感性材料[8]。本文采用聚氧乙烯(PEO)和聚氧丙烯(PPO)構成的嵌段共聚物泊洛沙姆P407和P188，作為凝膠基質，制備了加替沙星眼用溫敏凝膠劑(0.3%)，研究其流變學特性，通過透析膜法對體外釋藥行為進行研究。該劑型以滴眼液的形式滴入，在眼部膠凝，形成半固體凝膠，這種給藥系統具有給藥方便、準確，患者依從性好的特點。

1 儀器與試藥

島津高效液相色譜儀(日本島津)；電子天平(Sartorius BT125D)；透皮吸收儀TT-6(天津市正通科技有限公司)；透析膜(截留相對分子量為3500，美國聯碳公司)；Malven Kinexus 流變儀(Malven儀器公司)；加替沙星對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：130518-200402)；加替沙星溫敏凝膠(自制，批號：160302)；加替沙星滴眼液(自制樣品，批號：S160302)；乙腈、三乙胺、磷酸均為國藥集團化學試劑有限公司；水為純化水。

2 方法與結果

2.1 加替沙星溫度敏感眼用凝膠流變學性質研究。

2.1.1 觸變性 取凝膠約2 mL置流變儀錐板式模具上，溫度為25.0 ℃，在1 s-1連續剪切50 s后,立即將剪切速率增大至100 s-1連續剪切50 s；再將剪切速率恢復至1 s-1，繼續剪切50 s。記錄凝膠的動力黏度變化情況。本研究采用了三階段法分析樣品的觸變性。試驗表明，本品為觸變性較大的流體，結果見圖1。

圖1 加替沙星眼用溫敏凝膠觸變性掃描結果

2.1.2 黏度掃描 分別取凝膠和加替沙星滴眼液約2 mL置流變儀錐板式模具上，用CP4/40轉子，設定初始溫度為0 ℃，以5 ℃·min-1升溫，剪切速率為1 s-1，分別測定加替沙星眼用溫敏凝膠和滴眼液的黏度變化情況。結果表明在溫度升高至33 ℃左右，溫敏凝膠的黏度顯著上升，表明加替沙星眼用溫敏凝膠的狀態發生了明顯變化，由液態變為半固體狀態，符合溫敏凝膠的特性。而滴眼液黏度保持不變，結果見圖2。

圖2 加替沙星眼用溫敏凝膠和加替沙星滴眼液黏度掃描結果圖

2.2 體外釋放測定方法的建立

2.2.1 色譜條件 采用Agilent XDB C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色譜柱，以乙腈-三乙胺磷酸溶液[三乙胺溶液(1→100)磷酸調節pH值至4.0](20∶80)為流動相，流速1.0 mL·min-1，檢測波長325 nm，柱溫30 ℃。

精密稱取加替沙星對照品適量，加流動相溶解并稀釋制成每1 mL中約含50 μg的溶液，作為對照品溶液，結果見圖3。

圖3 加替沙星對照品溶液HPLC圖

取體外釋放各時間點的接收液，作為透過量測定的供試品溶液，結果見圖4。

圖4 供試品溶液HPLC圖

分別精密量取對照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，外標法計算，得供試品溶液中的藥物濃度。

2.2.2 溶液穩定性試驗 取對照品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12 h進樣，記錄色譜圖和峰面積。結果表明，對照品溶液12 h穩定性良好，峰面積的RSD為0.80%。取供試品溶液(1 h接受液)分別間隔兩個小時進樣，考察12 h溶液穩定性，記錄色譜圖和峰面積。結果表明，供試品溶液(1 h接受液)12 h穩定性良好，峰面積的RSD為1.01%。

2.2.3 空白干擾試驗 制備除加替沙星外的凝膠。取約0.4 g于25 mL量瓶，流動相定容至刻度，搖勻，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果表明空白不干擾加替沙星的測定。

2.2.4 線性關系考察 取加替沙星對照品適量，精密稱定，用流動相溶解并定量稀釋成6.02、12.04、24.08、36.12、48.16、60.21、72.24 μg·mL-1的溶液，作為對照品線性溶液，以濃度對峰面積做線性回歸，得回歸方程：A=10.263X-1.775 4，r=0.999 9，結果表明，濃度在 6.02～72.24 μg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.2.5 精密度試驗 精密量取線性測定項下的48.16 μg·mL-1的溶液，連續進樣6次，記錄色譜圖和峰面積，考察該方法的重現性。結果，加替沙星峰面積的RSD為0.72 %。

2.2.6 檢測限和定量限 精密稱取加替沙星對照品適量，加流動相溶解并用流動相定量稀釋，制成不同倍數的系列溶液，按上述色譜條件進行測定。測得加替沙星定量限為0.32 ng(S/N≈10)，檢測限為0.10 ng(S/N≈3)。

2.2.7 回收率 分別精密稱取處方量的80%、100%、120%的加替沙星原料藥及相應量空白基質于燒杯中，攪拌均勻，各精密稱取供試品0.40 g至25 mL量瓶，流動相定容至刻度搖勻。另精密稱取加替沙星對照品約5 mg，置100 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液，同法測定。按外標法以峰面積計算，即得。測得平均回收率為98.78%，RSD為1.18 %，結果見表1。

2.3 加替沙星溫度敏感眼用凝膠的體外釋放試驗

2.3.1 測定方法—透析膜法[9]采用Franz擴散池，以累積透過量、滲透速率為檢測指標，考察樣品經膜吸收情況。

將新鮮處理的透析膜固定于Franz擴散池的供給池和接收池之間。取凝膠約0.2 g均勻涂于膜上層。接收介質為人工淚液(取氯化鈉6.7 g，碳酸氫鈉2 g，二水合氯化鈣0.08 g，加水至1 000 mL，即得)。接收池體積為12 mL，內徑1.8 cm。擴散池外34 ℃水浴循環，接收池內300 rpm恒速攪拌。分別于 0.5、1、2、4、6、8、12 h取樣，每次抽取接收液2 mL，取樣后及時補加等溫接收介質2.0 mL并排除接收室中的氣泡。所取樣品經0.45 μm濾膜過濾后注入液相色譜儀，測定含量，并計算樣品在各時間點的累積溶出率。

表1 回收率測定結果

2.3.2 結果 所得釋藥情況如圖5所示。加替沙星溫敏凝膠2 h累積釋放約為32%，4 h累積釋放約為40%。體外釋藥研究表明加替沙星眼用溫敏凝膠緩釋效果明顯，未出現突釋效應，在12 h內累積釋藥量達到61%。

采用Origin8.0軟件將加替沙星溫敏眼用凝膠0.5～12 h累積釋放率的數據進行數學模型擬合，發現以零級動力學方程、一級動力學方程、Higuchi方程和Ritger-Pepps方程擬合所得相關系數分別為0.875 59、0.895 15、0.970 83和0.990 96，Higuchi方程和Ritger-Pepps方程均能較好地模擬凝膠中藥物的釋放行為，根據Ritger-Pepps方程的擬合結果n=0.990 96，說明該處方體外釋藥機制以擴散為主。

圖5 加替沙星眼用溫敏凝膠累積釋放度-時間曲線(n=4)

3 討論

本研究成功制備了一種加替沙星溫敏凝膠，流變學研究表明，該凝膠在低于25 ℃

下呈液態，為低黏彈性的牛頓流體，眼部給藥后，可快速膠凝，凝膠強度增大，展示出假塑性流體特點。本品觸變性較大，在低剪切時有較高黏度；在高剪切時有較低黏度；再恢復低剪切時，黏度也快速恢復。當以液態滴入眼部，隨著眼瞼的眨動，剪切變稀，利于迅速涂布，同時，因其溫敏特性，導致在用藥過程中，變為半固態，有利于藥物在眼部的滯留，從而延長給藥時間[10]。

本研究采用了透析膜法來模擬溫敏凝膠在實際給藥過程中藥物通過角膜的釋放過程。本品體外釋放結果與Ritger-Pepps方程擬合較好。其體外釋放可長達12 h。藥物均勻分散在高分子骨架中，水凝膠骨架遇接受液，快速膠凝，凝膠骨架內部藥物緩慢釋放，溶到接受液中，利用擴散方式傳遞藥物。同時，與接受液接觸凝膠層骨架溶蝕，水分向凝膠內部滲透，藥物進一步得到釋放。釋放前期，隨著時間延長，藥物釋放緩慢，中后期，由于骨架中藥物量的減少，釋藥速率減慢。實際上，釋藥過程是凝膠骨架的溶蝕和藥物擴散綜合作用的結果[11-12]。

本品對眼部刺激性小，獨特的溫敏特性使藥物在眼部滯留時間長，提高藥物的生物利用度，同時具有緩釋藥物的特點。