四唑化合物開環反應、晶體結構及相關抗微生物作用研究

房鵬金，齊冉，趙志龍，張慧珍

(臨沂大學藥學院，山東 臨沂 276000)

隨著抗生素的廣泛使用甚至濫用，導致多藥耐藥菌株頻發，嚴重威脅人類健康。近年來，將兩種或兩種以上的臨床藥物聯用所產生的協同作用，常能克服多藥耐藥性，并提高藥效和生物利用度。然而，對新型抗微生物藥物的研發仍迫在眉睫，是藥物化學家面臨的嚴峻挑戰。

四唑化合物作為一種重要的多氮芳雜環，能夠發生多種非共價鍵相互作用，在醫藥、農藥、化學、超分子等領域具有較大的應用前景[1-2]。因此，四唑化合物的合成和應用研究工作眾多。值得一提的是，四唑類化合物不僅在醫藥領域顯示出廣泛的應用[3-4]，如抗高血壓藥物奧美沙坦酯、坦坎地沙坦酯以及抗生素頭孢雷特等，在農藥領域[5-6]如除草劑四唑嘧磺隆，而且在材料領域[7-8]，由于四唑類化合物結構穩定、含氮量高且生成焓高的特點，在起爆藥、固體推進劑等含能材料的制備中應用普遍，此外，其在燃料電池、抗金屬腐蝕、光敏材料和化學催化劑等方面的研究也較為活躍。因而，其廣泛的潛在應用吸引了越來越多的努力致力于四唑類化合物的合成研究。

氨基四唑類化合物作為四唑類化合物的重要一員，其在醫藥領域的廣泛應用同樣吸引了無數研究致力于其合成研究[9]。基于課題組對唑類抗微生物化合物的研究，我們意外分離得到了氨基四唑環開環的結構產物(見圖1)，其結構經X-射線單晶衍射，并考察了所合成化合物的體外抗細菌抗真菌活性，與臨床藥物的聯用效果，以及與小牛胸腺DNA的相互作用。

圖1 氨基四唑的開環反應

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑 核磁共振儀(Bruker AV 300核磁共振儀)；電熱鼓風干燥箱(鄭州長城科工貿有限公司)；臺式恒溫振蕩器(太倉市實驗設備廠)；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫療機械廠)；X-射線單晶衍射儀(日本理學Gemini E型單晶衍射儀，北京理化賽思科技有限公司)。

硅膠(青島海洋化工廠)；乙酰苯胺(國藥集團化學試劑有限公司)；氯磺酸、5-氨基四唑無水K2CO3、無水Na2SO4均為天津市恒興化學試劑有限公司；二氯甲烷、丙酮、氯仿均為天津市富宇精細化工有限公司；氟康唑(富陽金伯士化工有限公司)；諾氟沙星(重慶科瑞制藥有限責任公司)；氯霉素(四川泰華堂制藥有限公司)；小牛胸腺DNA(北京百泰生物技術公司)。

1.2 合成或制備

1.2.1 4-乙酰氨基苯-1-磺酰氯(4-acetamidobenzene-1-sulfonyl chloride)2的合成 在冰浴條件下，向化合物乙酰苯胺1(10.002 g,0.074 1 mol)中逐滴加入25 mL氯磺酸，攪拌至固體完全溶解后，將反應體系轉移至60 ℃油浴中，繼續反應2 h，冷卻至室溫.緩慢將反應體系倒入碎冰中，會產生大量的白色固體，抽濾，烘干濾餅得到白色固體2為16.212 g。

1.2.2 目標化合物3的合成 稱取5-氨基四唑(3.658 g,0.043 mol)與無水碳酸鉀(7.031 g,0.051 mol)于100 mL圓底燒瓶中，加入適量丙酮50 mL做溶劑，在50 ℃下攪拌反應1 h后，冷卻至室溫.然后加入化合物2(10.008 g,0.043 mol)，繼續室溫下攪拌。用薄層色譜(展開劑:二氯甲烷/丙酮，5/1，體積比)跟蹤反應。反應結束后，減壓蒸出大部分丙酮后，加水30 mL，用氯仿(3×50 mL)萃取，合并有機相，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，經柱色譜分離(展開劑：二氯甲烷/丙酮，5/1，體積比)，析出塊狀無色透明晶體3，產率約70%。1H-NMRδ:11.32(s,1H,NH),10.32(s,H,NHCOCH3),7.82(d,2H,J=4.0 Hz,Ph-2,6-H),7.76(d,2H,J=4.0 Hz,Ph-3,5-H),2.09(s,3H,COCH3)。

1.4 抗細菌抗真菌活性測試 采用美國國家實驗室標準委員會(NCCLS)[10]推薦的藥敏實驗方法進行化合物的抗細菌抗真菌活性測試。首先，二甲基亞砜(DMSO)溶解化合物和參考藥物，配成 12.8 mg·mL-1溶液，并用無菌肉湯稀釋至1 024 μg·mL-1。在無菌96孔板的每個孔中均加入100 μL菌液，采用倍比稀釋法，將受試藥液加入96孔板中的1～11號孔，使各孔中的藥物濃度分別為512、256、128、64、32、16、8、4、2、1 和 0.5 μg·mL-1，12號孔不含藥物，作陽性對照，此時，各孔中DMSO含量均低于1%，排除了溶劑DMSO對活性測試結果的影響。將96孔板在37 ℃恒溫搖床上培養24 h。

1.5 化合物與臨床藥物聯用活性測試 根據所測得的化合物3以及臨床藥物對測試細菌和真菌的MIC值，采用棋盤法，測定化合物與臨床藥物聯用時，對細菌或真菌的抑制能力。聯合作用效果用FIC指數來表征。FIC指數= 聯合用藥后化合物的MIC值/聯合用藥前化合物的MIC值 + 聯合用藥后臨床藥物的MIC值/聯合用藥前臨床藥物的MIC值。 FIC≤1，兩者為協同作用；12，兩者之間為拮抗作用[11]。

1.6 化合物與小牛胸腺DNA相互作用研究 采用紫外-可見光譜法初步研究化合物3與小牛胸腺DNA的相互作用。通過化合物3和小牛胸腺單獨存在時吸光度之和和共存時吸光度值進行比較，增色性是由于破壞DNA的雙螺旋結構引起的，化合物嵌插入DNA的雙螺旋結構則造成吸光度降低。

2 結果與討論

2.1 晶體結構 化合物3溶于二氯甲烷和丙酮的混合溶液中，其單晶是在室溫下隨著溶劑緩慢蒸發而生長的。化合物3的主要晶體結構參數和氫鍵數據見表1～2。

表1 化合物3的晶體學數據

表2 化合物3中氫鍵的鍵長、鍵角數據

注：對稱性操作代碼：(i)x,y,z-1;(ii)-x+1,-y+2,-z+1;(iii)x,y+1,z;(iv)-x,-y+2,-z+1

圖2是化合物3的晶體結構，從圖中可以看出化合物含有一個結晶水，以水合物形式存在。化合物3分子間通過氧原子、乙酰氨基氮原子和氨基氮原子形成氫鍵，進而形成三維超分子結構，其沿a方向的空間堆積圖如圖3所示。

圖2 化合物3的晶體結構圖

圖3 化合物3垂直于a軸方向的三維堆積圖

2.2 抗細菌抗真菌活性 化合物2和3的體外抗細菌、抗真菌數據見表3。測試的細菌有：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌3種，和白色念珠菌、假絲酵母菌以及黃曲霉菌3種真菌。活性測試中分別選用氯霉素、諾氟沙星和氟康唑作為參考藥物。

表3 化合物2和3的抗細菌和抗真菌活性(MIC,g·mL-1)

體外抗細菌和抗真菌活性結果表明：化合物2和3對所測試的細菌和真菌表現出弱到中等(MIC=64～256 μg·mL-1)的抑制活性.與參考藥物氟康唑相比，化合物對耐氟康唑的黃曲霉菌的抑制活性強于氟康唑(MIC=256 μg·mL-1)。

2.3 化合物與臨床藥物聯用活性 化合物3與臨床藥物氯霉素或諾氟沙星的聯用抗細菌活性結果如表4所示。當氯霉素濃度為2～4 μg·mL-1或諾氟沙星濃度為0.25～1 μg·mL-1時，與化合物3聯用即可顯示有效的抗細菌活性，較單獨用藥時，劑量顯著減少，抗菌能力明顯增強.所有聯用體系的FIC指數均小于1，顯示較好的協同作用效果。

表4 化合物3和抗細菌藥氯霉素或諾氟沙星的聯用效果

臨床藥物氟康唑與化合物3的聯用抗真菌活性結果(見表5)表明，化合物3與氟康唑的聯用體系顯示較好的抗白色念珠菌、假絲酵母菌和黃曲霉菌活性。當氟康唑濃度為0.25～1 μg·mL-1時，與一定濃度的化合物3(16～64 μg·mL-1)聯用，即可顯示較好的抗真菌活性。特別是對于耐氟康唑的黃曲霉菌，聯用體系給出較好的抑制作用。因此，有望通過氟康唑與化合物的聯用，拓寬氟康唑的抗真菌譜，改善其因用藥劑量大而導致的毒性和耐藥性等問題。

表5 化合物3和抗真菌藥氟康唑的聯用效果

2.4 化合物與小牛胸腺DNA的相互作用 DNA作為生物體中的重要生物大分子，對各種生命活動有著非常重要的作用，而且，其作為眾多臨床藥物的主要靶分子，引起了廣泛的關注。化合物與DNA的相互作用研究能夠為新型DNA靶標藥物的設計提供重要的理論指導。小牛胸腺DNA因其價廉易得等，而被普遍選擇為研究的模型。利用紫外-可見光譜法研究了化合物3與小牛胸腺DNA的相互作用，初步從分子水平上探討了其可能的抗微生物作用機制[12]。

一般認為，DNA吸收光譜的減色紅移現象是由于化合物與DNA發生了嵌插作用，其芳香發色團與DNA的堿基對發生強烈的堆積，形成了DNA-化合物復合物導致；而增色性則是因為DNA雙鏈的二級結構被破壞引起[13]。在圖4中，隨著化合物3濃度的增加，在260 nm處的DNA的吸光度比例增大。化合物3-DNA復合體系的吸光度值稍小于相應濃度的游離的化合物和DNA的吸光度之和(見圖5)，說明DNA的吸收光譜顯示減色效應，其可能是因為化合物3嵌入DNA雙螺旋結構，形成大的共軛體系引起[14]。

圖4 DNA在不同濃度的化合物3存在下的紫外吸收光譜(pH=7.4,室溫)

圖5 260 nm處3-DNA復合物的吸光度以及游離的DNA與游離化合物3的吸光度之和

根據在化合物3存在下，DNA吸收光譜的變化，可用方程(1)分析計算DNA與化合物的結合常數K[15]。

(1)

A0和A分別代表沒有和有化合物3存在下的DNA吸光度值，ξC和ξD-C表示化合物3和3-DNA體系的吸收系數，根據方程和吸收滴定擬合曲線圖，可計算出相應的結合常數K=1.14×104L·mol-1，r=0.999，SD=0.08。

中性紅(NR)可嵌插入DNA結構中，而且其本身毒性很低，水溶液可長時間放置。因此，選用中性紅作為光譜探針研究化合物3與DNA的相互作用模式。圖6顯示了NR染料在DNA加入過程中的吸收光譜變化。結果表明，隨著DNA濃度的增加，NR在460 nm附近的吸收峰逐漸減小，而在530 nm處出現一個新的吸收峰，這歸因于新的DNA-NR復合物的形成，在504 nm處的等色點為DNA-NR復合物的形成提供了證據[16]。

圖6 中性紅在不同濃度DNA下的紫外吸收光譜(pH=7.4,T=室溫)

圖7顯示了中性紅和化合物3與DNA競爭結合的吸收光譜。隨著化合物3濃度的增加，最大吸收峰在530 nm的DNA-NR復合物的吸收下降，而在460 nm處的吸收略微增強，與隨著DNA濃度增加時游離NR在460 nm左右的吸收相比(見圖6)，圖7中的吸收光譜顯示出相反的過程。因此，化合物3可能插入到DNA的雙螺旋結構，代替NR，與DNA發生絡合，形成化合物3-DNA復合物。

圖7 DNA在中性紅與化合物3競爭下的紫外吸收光譜

3 結論

本實驗使用5-氨基四唑1和4-乙酰氨基苯磺酰氯2反應得到四唑開環化合物3，其結構經X-射線單晶衍射證實。結果表明，5-氨基四唑斷鍵開環生成疊氮化物3含有一個結晶水分子，屬于P-1空間群，晶胞參數a=7.555 4(5)?，b=8.816 3(4)?，c=11.051 6(7)?，=75.46 3(5)，=89.813(5)，=69.166(6)。化合物通過氧原子、氮原子和氫原子形成氫鍵，進而形成三維超分子結構。抗微生物活性測試結果顯示，所合成的化合物對所測試的細菌和真菌顯示了較弱到中等(MIC=64～256 μg·mL-1)的抑制活性，與參考藥物氟康唑相比，化合物對耐氟康唑的黃曲霉菌的抑制活性強于氟康唑(MIC=256 μg·mL-1)。此外，將化合物3與參考藥物聯用后，所有聯用體系的FIC指數均小于1，抗微生物能力明顯增強，減少了用藥劑量，拓寬了抗微生物譜，顯示較好的協同作用效果。因此，有望通過化合物與臨床藥物的聯用，改善其因用藥劑量大而導致的毒性和耐藥性等問題。紫外-可見光譜法顯示，化合物3與小牛胸腺DNA共存時其吸光度值小于單獨存在時的吸光度之和，所以化合物3可能通過嵌入的方式與DNA形成復合物，進而發揮抗微生物作用。