肝臟特異性I型11β-羥基類固醇脫氫酶轉基因小鼠肝臟核糖核酸測序差異表達基因分析研究

胡蒙亮 任航江 韓亭亭 滿永 黎健 李國平

隨著生活方式的改變和肥胖的流行，非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease， NAFLD)已發展成為一個世界性的健康問題，其病理表現為肝臟中TG的異常積累超過肝重的5%[1]。而另一方面，脂質代謝異常也是心血管疾病的危險因素，與動脈粥樣硬化的發生發展密切相關[2]。研究表明，I型11β-羥基類固醇脫氫酶(11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1，11β-HSD1)在脂質代謝中發揮重要作用[3]，但具體機制仍然知之甚少。

近年來，隨著基因測序技術的發展，RNA-seq已成為基因研究中不可或缺的強大平臺，對尋找生物標志物和研究疾病機制有非常重要的意義[4]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是超過200個核苷酸組成的轉錄物，其缺乏蛋白質編碼能力，在轉錄調控和表觀遺傳中有重要作用[5]。lncRNA參與多種生物學過程，如細胞分化，腫瘤發生，免疫應答等[6]。已有研究顯示，lncRNA是NAFLD發展的重要調節因子[7]，lncRNA的遺傳變異與NAFLD的風險密切相關。然而 lncRNA是否參與了肝臟特異性 11β-HSD1轉基因小鼠肝臟的脂質蓄積過程尚不清楚。

為了揭示lncRNA和mRNA在肝臟特異性11β-HSD1轉基因小鼠肝臟脂質蓄積中發揮的作用，本研究應用RNA-seq技術結合生物信息學分析肝臟特異性 11β-HSD1轉基因小鼠肝臟 mRNA和lncRNA表達譜的特點，從新的視角探討NAFLD的發病機制，為NAFLD的治療提供新的思路與線索。

材料與方法

1.動物飼養和肝臟樣本提取 從人的肝臟提取RNA后反轉錄為cDNA，再以cDNA為模板擴增出目的序列11β-HSD1，并以白蛋白為啟動子構建表達載體。將構建好的表達載體酶切線性化后顯微注射入小鼠受精卵原核，并移植入同期發情的假孕母鼠輸卵管中，獲得轉基因小鼠的F0代，通過回交和PCR鑒定篩選出穩定表達11β-HSD1的品系為肝臟特異性11β-HSD1轉基因小鼠，并以PCR鑒定11β-HSD1為陰性的同窩小鼠作為野生型。將小鼠保持在溫度和濕度特定(20～24℃，45%～55%濕度)的環境中，可自由獲取食物和水，并經北京醫院動物倫理委員會批準。在3個月齡時分別收集來自不同組小鼠的肝臟組織。

2.材料 乙酰輔酶A羧化酶(ACC1)，硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD1)、脂肪酸合成酶(FAS)抗體購自Cell Signaling Technology。固醇調節元件結合蛋白(SREBP1)抗體購自美國Santa Cruz公司。11β-HSD1抗體購自美國R＆D公司；HRP標記的山羊抗兔IgG相關抗原抗體、HRP標記的兔抗山羊IgG相關抗原抗體、β肌動蛋白(β-actin)抗體購自北京中杉金橋生物公司。BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自美國Thermo公司。動物飼料購自北京華阜康生物科技股份有限公司。

3.TG檢測 喂養小鼠3個月齡時，禁食4 h并稱量小鼠體質量，進行麻醉處死后收集肝臟組織，稱重后凍于液氮備用。切取肝臟組織100 mg左右，根據參考文獻[8]進行肝臟脂質內容物提取，酶法測定TG含量。

4.油紅O染色 取小塊肝臟組織，OCT包埋，切為8～10 μm厚的冰凍切片并貼片于潔凈載玻片。10%甲醛固定15 min，PBS洗1 min，60%異丙醇浸洗數秒，取出切片并完全干燥后油紅O工作液室溫染色30 min，60%異丙醇分化數秒，PBS洗3次，蘇木素復染核8 s，流水沖洗返藍，甘油封片后鏡檢，照相。

5.蛋白質印跡 通過10%SDS-PAGE凝膠電泳分離肝臟組織蛋白提取物(20μg蛋白質)，PVDF膜(Millipore)濕轉3 h，用8%脫脂奶粉封閉1 h，然后與相應一抗在4℃溫育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min。相應二抗室溫孵育3 h，TBST洗膜3次，每次10 min，用化學發光液顯影，并用凝膠成像儀照相。采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

6.RNA樣品質量檢測及文庫構建 提取兩組樣品肝臟組織總RNA，在各組中分別將三個樣本混合成一個樣本，并重新編號。Nano Drop ND-1 000分光光度計對RNA濃度及質量進行評估(2.2＞OD260/OD280＞1.8)；瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA純度。將純化的RNA斷裂為長度接近200 bp的碎片，將處理后的RNA片段反轉錄為cDNA，進行文庫構建。

7.RNA測序及生物信息學分析 使用Illumina HiSeqTM2500工作平臺進行測序。通過軟件Tophat2將測序獲得的核苷酸長度(Reads)比對至小鼠全基因組。使用DEG seq軟件包計算基因差異表達情況。根據差異表達倍數、P值和表達量(FPKM)篩選差異表達的mRNA和lncRNA(差異倍數＞1.5，P＜0.05且 FPKM＞0.5)。 FPKM(Fragments Per Kilo bases per Million fragments)，即每百萬測序片段中來自某一基因/轉錄本每千堿基長度的片段數目，表示表達豐度，FPKM

通過GO和KEGG PATHWAY分析對差異表達的基因進行生物學過程的富集和脂質代謝通路的分析，篩選出與脂代謝相關的差異顯著的mRNA和lncRNA。GO分析時通常采用二級或更低水平的分類：細胞學組件(cellular component，CC)，用于描述亞細胞結構、位置和大分子復合物，如核仁、端粒和識別起始的復合物等；分子功能(molecular function，MF)，用于描述基因、基因產物個體的功能，如與碳水化合物結合或ATP水解酶活性等；生物學途徑(biological process，BP)，指分子功能的有序組合，達成更廣的生物功能，如有絲分裂或嘌呤代謝等。目標基因集合的Pathway的分類和富集分析，提示不同基因如何相互協調行使其生物學功能，有助于進一步了解基因的生物學功能。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes京都基因和基因組百科全書)是有關Pathway研究的主要公共數據庫。KEGG系統分析基因功能、基因組信息數據庫，通過圖形來表示細胞內的生物學過程，例如代謝，膜運輸，信號傳導和細胞的生長周期。

8.實時熒光定量PCR檢測 隨機選取部分與脂質代謝相關的顯著上調/下調的mRNA和lncRNA進行實時熒光定量PCR檢測驗證其表達水平。利用primer軟件根據NCBI中基因序列設計引物(表1)，引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。收集15 mg肝組織用TRIZOL試劑(Invitrogen，USA)提取總RNA，測定濃度及RNA質量后，取5μg RNA逆轉錄成cDNA第一鏈，將cDNA稀釋20倍后進行目的基因的檢測，總反應體系為 20 μL：2ΧSYBR Green PCR Mix 10 μL，上下游引物各 1μL，模板cDNA 1 μL，加 ddH2O 補齊至20 μL。 反應完畢后分析產物溶解曲線判斷反應的特異性并通過計算2-△△ct得到目的基因的相對表達量(實驗樣品以β-actin為內參，以野生型-1為基準)，并與 RNA測序結果進行對比。

表1 檢測基因的引物

9.統計學方法 應用GraphPad Prism 6.0軟件進行數據處理并繪制統計圖。計量資料以均數±標準差表示，采用t檢驗進行比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.肝臟特異性11β-HSD1轉基因小鼠肝臟脂質蓄積 與野生型小鼠相比，實驗組小鼠肝臟11β-HSD1顯著增加[(1.000±0.051)vs.(3.486±0.135)，P＜0.001，圖 1 A]，但兩組小鼠體質量并差異無統計學意義，體質量分別為[(31.33±2.89)vs.(32.72±3.47)，圖 1B]。實驗組小鼠肝質量為(1.91±0.11)g，顯著高于野生型小鼠的(1.52±0.12)g(P＜0.05，圖1C)，并且實驗組小鼠的肝臟質量/體質量的比值也顯著高于野生型小鼠[(0.046±0.005)vs.(0.059±0.006)，P＜0.05，圖1D]。油紅O染色顯示相較于野生型小鼠，實驗組小鼠肝臟組織脂滴大而富集(圖1F)。除此之外，酶法定量檢測TG含量結果顯示實驗組肝臟TG含量增加[(39.61±3.32)vs.(75.47±3.15)，P＜0.05，圖1E]，這一結果與油紅O染色結果相一致，進一步證實肝臟特異性 11β-HSD1轉基因小鼠肝臟脂質蓄積。

圖1 肝臟特異性11β-HSD1轉基因小鼠表型 A：小鼠肝臟組織11β-HSD1蛋白表達水平；B：小鼠體質量統計圖；C：小鼠肝質量統計圖；D：小鼠肝質量/體質量比值統計圖；E：肝臟組織中TG含量測定結果；F：肝臟組織中脂質油紅O染色結果 注：與對照組比較，n＝10，?P＜0.05， ???P＜0.001

圖2 肝臟特異性11β-HSD1轉基因小鼠肝臟脂質合成相關蛋白增加 A：Western blot檢測脂質合成相關蛋白水平；B：Western blot條帶灰度分析統計圖 注：n＝10，?P＜0.05，??P＜0.01，???P＜0.001

2.肝臟特異性11β-HSD1轉基因小鼠脂質合成相關蛋白表達顯著增加 對兩組小鼠肝臟組織提取總蛋白后，首先檢測了長鏈脂肪酸合成途徑中主要的調控蛋白，結果顯示(圖2)，相較于野生型小鼠，肝臟特異性 11β-HSD1轉基因小鼠肝臟組織中SREBP1顯著增加(P＜0.05)，其下游調控蛋白FAS(P＜0.001)，SCD1(P＜0.01)也明顯上調，脂肪酸合成通路重要蛋白ACC1表達顯著升高(P＜0.01)。這些結果說明肝臟特異性11β-HSD1轉基因小鼠脂質合成通路被激活了，11β-HSD1基因的過表達可能是導致肝臟脂質蓄積的原因之一。

3.lncRNA和mRNA的差異表達譜和基因途徑分析 收集野生型小鼠和肝臟特異性11β-HSD1轉基因小鼠肝臟標本進行RNA-seq測序，獲得mRNA和lncRNA的差異表達譜，發現有323條lncRNA發生改變，其中123條上調，200條下調。與野生型小鼠肝臟樣本相比，實驗組中約825條mRNA(376條上調和 449條下調)表達不同。此外，有 13條lncRNA和5條mRNA在實驗組的表達差異倍數超過野生型小鼠的5倍。為了闡明差異表達基因在肝臟特異性11β-HSD1轉基因小鼠肝臟脂質蓄積中的生物學過程和分子機制，進一步對其進行了GO富集和通路富集分析。結果顯示差異表達的RNA主要參與脂質代謝、脂質生物合成和脂肪酸代謝等生物學過程。在脂代謝相關通路中，共有 198條lncRNA差異表達，其中72條上調，126條下調；同時發現了77條差異表達的mRNA(35條上調，42條下調)。表2中顯示了脂質代謝途徑中10個最豐富的GO條目。表3中顯示了與脂代謝相關的差異最顯著的10個上調和下調的mRNA。表4中顯示了與脂代謝相關的差異最顯著的10個上調和下調的lncRNA。

表2 差異最顯著的10個脂質代謝生物學過程富集的GO條目

表3 差異最顯著的10個上調和下調的mRNA

表4 差異最顯著的10個上調和下調的lncRNA

4.實時熒光定量PCR驗證 為了驗證RNA-seq結果，在篩選出的與脂代謝途徑相關的顯著上調/下調的 mRNA和 lncRNA中隨機選擇 10條(上調Apoa5， Pltp， Tecr， NONMMUT015228.2， NONMMUT026827.2； 下 調 Apoc3， Hsd3b7， Abca8a，NONMMUT006006.2， NONMMUT044708.2)，進行實時熒光定量 PCR檢測(n＝10)。檢測結果與RNA-seq數據一致，表明RNA-Seq測序結果準確可信。但實時熒光定量PCR檢測結果所示的差異表達倍數要比RNA-Seq測序的結果小，這可能是測序數據放大了RNA表達倍數差異。

圖3 實時熒光定量PCR驗證部分基因表達水平(以野生型-1為基準)

討 論

NAFLD是一種常見的肝臟疾病，影響30%的發達國家和越來越多的發展中國家人口，嚴重危害人類健康[9]。研究表明，11β-HSD1與肝臟脂質代謝密切相關[3]，在NAFLD的發生過程中發揮重要作用，但其發病機制仍然知之甚少。

11β-HSD1作為糖皮質激素的局部活化酶，其過表達是肝臟脂質蓄積的重要因素。以前的研究結果顯示，脂肪組織特異性過表達11β-HSD1的轉基因小鼠表現為完全代謝綜合征，包括血脂異常，胰島素抵抗性糖尿病和高血壓[10]。肝臟過表達11β-HSD1的小鼠發展為脂肪肝，胰島素抵抗和高血壓，但不表現為肥胖[11-12]。本研究采用肝臟組織特異性11β-HSD1轉基因小鼠模型，檢測到肝臟脂質大量蓄積，形成脂肪肝，而體質量并未發生改變。長鏈脂肪酸合成通路被激活，脂肪酸合成途徑的主調控因子SREBP1表達顯著增加，同時激活了下游通路FAS、SCD1的表達，脂質合成相關蛋白ACC1含量也顯著增加。這為11β-HSD1過表達后引起肝臟脂質蓄積提供了一個解釋。此外，缺乏11β-HSD1的小鼠能夠抵抗飲食誘導的肥胖，并且增加胰島素敏感性[13]。這些研究均表明11β-HSD1對于肝臟脂質蓄積的作用。

lncRNA是由長度大于200個核苷酸組成的非編碼RNA，可通過多種方式參與基因的調控和蛋白質的合成，影響代謝過程，并與多種疾病的發生和發展密切相關[14]。越來越多的證據表明lncRNA可能在NAFLD的發生、發展中起著重要的調控作用。Yuan等[5]使用基因芯片檢測了高脂飲食誘導的NAFLD模型小鼠肝臟組織中lncRNA的差異表達譜，表明lncRNA可能參與了小鼠NAFLD的過程。Guo等[15]研究發現，臨床用于治療NAFLD的藥物二甲雙胍可通過干擾lncRNA的表達而達到治療目的。這些研究提示探尋lncRNA在NAFLD中的作用機制利于實現對NAFLD的靶向治療。

本實驗通過RNA-seq技術及生物信息學分析對肝臟組織特異性11β-HSD1轉基因小鼠肝臟的lncRNA和mRNA表達譜的改變進行了初步探索。根據基因功能聚類和途徑分析發現，差異表達的mRNA和lncRNA涉及到脂代謝在內的多個方面，提示其參與脂質代謝調控，從而影響了肝臟特異性11β-HSD1轉基因小鼠肝臟脂質蓄積的過程。在脂代謝相關通路中，共有198條lncRNA差異表達，其中72條上調，126條下調；同時發現了77條差異表達的mRNA(35條上調，42條下調)。隨機挑選10條基因進行實時熒光定量PCR驗證，差異變化結果與測序數據基本一致。本研究的另一發現是，在富集的前十條脂代謝相關通路中反復出現了Apoa5。Apoa5在肝臟中顯著表達，其編碼的蛋白質是載脂蛋白，是幾種脂蛋白如VLDL、HDL、乳糜微粒的組分，影響血漿TG水平[16]。在本研究的測序結果中，發現肝臟組織特異性11β-HSD1轉基因小鼠樣本中Apoa5表達相比野生型升高了2.3倍，實時熒光定量PCR的結果也與其一致。之前已有研究報道，Apoa5參與NAFLD的發展[17]。在HepG2細胞中敲低apoA5導致細胞內TG含量顯著降低[18]。二甲雙胍通過抑制肝臟Apoa5表達降低ob/ob肥胖小鼠的血漿 TG[19]。此外，與Apoa5共表達的 lncRNA NONMMUT039532.2和lncRNA NONMMUT065550.2均表現為約7倍的上調，提示其可能通過Apoa5參與脂代謝的調控。

目前關于lncRNA與疾病關系的研究，大多利用基因芯片、RNA-Seq等技術對lncRNA的表達情況進行全面的篩選，得到基因差異表達譜并進一步功能驗證。然而不同的基因篩選技術存在較大差異[20]。相較于微陣列芯片技術，RNA-Seq具有檢測范圍更廣、定量更準確、可重復性更高、分析更可靠、需要的樣本量更少等優勢。但是，RNA-seq也面臨著一些挑戰，包括大量的數據信息處理和分析等。

總之，本研究檢測了兩組肝臟樣本RNA的表達譜，初步篩選出顯著差異表達的mRNA和lncRNA，為下一步分子機制的研究提供實驗依據。后續將進一步通過基因過表達和RNA干擾等技術方法對以上篩選出的差異表達的RNA進行功能驗證，以揭示其在肝臟特異性11β-HSD1轉基因小鼠肝臟脂質蓄積中的作用機制。