巨噬細胞特異性敲除一磷酸腺苷激活依賴性蛋白激酶基因的小鼠模型構建

鄭帥 劉燕 樸春梅 劉婷婷 王吉靜 王綠婭 杜杰

高血壓是最常見的心血管疾病之一，我國18歲以上人群患病率約為23%[1]；高血壓也是導致中風、心梗、主動脈瘤等諸多心腦血管疾病的重要危險因素[2]。巨噬細胞參與調節鈉敏感性的血壓變化[3]，更廣泛參與高血壓狀態下的心臟、腎臟、腦等靶器官的炎癥反應和病理生理改變[4]，但其作用機制尚不完全清楚。一磷酸腺苷激活依賴性蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)是調節細胞能量代謝和功能的核心激酶，其催化亞單位(α subunit)在巨噬細胞中主要表達為α1型(PRKAA1)。既往報道中，AMPK信號通路能夠抑制巨噬細胞的致炎功能，使之更多的表現為抗炎表型[5]。因此，AMPK可能是介導巨噬細胞對于血壓調節和高血壓條件下靶器官損傷的重要調控分子。故本研究采用Cre/loxP重組酶系統，構建和培育巨噬細胞特異性敲除AMPKα1基因的小鼠，在此基礎上初步檢測這種敲除對于血壓的影響，為進一步研究巨噬細胞AMPK信號通路在高血壓疾病損傷中的作用和機制奠定基礎。

材料與方法

1.儀器和試劑 電加熱模塊(美國 Thermo Fisher公司)，凝膠電泳儀、凝膠成像儀、Real-time PCR儀(美國Bio-Rad公司)，核酸熒光定量儀(美國Thermo Fisher-Invitrogen公司)，小動物血壓心電系統(國產森西公司)。他莫昔芬(美國Sigma公司)，鼠尾消化液DirectPCR(美國VIAGEN公司)，蛋白酶K和Taq-Master Mix 2X(康為公司)，TRIzol試劑(美國Thermo Fisher-Invitrogen公司)，反轉錄試劑盒(美國Promega公司)，SYBR聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒(日本TaKaRa公司)，基因型鑒定和Real-time PCR檢測用的引物對(北京諾賽基因組研究中心有限公司)。

2.實驗動物及分組 AMPKα1-loxP轉基因小鼠(AMPKα1fl/wt)，以及集落刺激因子受體的啟動子(colony stimulating factor 1 receptor，Csf1r)驅動表達雌激素受體-Cre融合蛋白的轉基因小鼠(Csf1r-MeriCre-Mer)，均購自美國 Jackson實驗室，均為C57BL/6 J品系背景。兩種小鼠雜交繁育，子代進一步雜交，培育攜帶純合型AMPKα1-loxP和Cre(或不攜帶 Cre)的轉基因小鼠(AMPKα1fl/fl/Csf1r-MerCre及 AMPKα1fl/fl/WT)。實驗小鼠均飼養于SPF級環境，恒溫恒濕，12 h明-暗晝夜節律。本實驗得到北京安貞醫院倫理委員會批準。

3.培育條件誘導的組織特異性敲除AMPK的小鼠 將AMPKα1-loxP轉基因小鼠相互交配，得到AMPKα1fl/fl轉基因小鼠，再與Csf1r-MerCre轉基因小鼠雜交，得到AMPKα1fl/fl/Csf1r-MerCre轉基因小鼠，以及AMPKα1fl/fl/WT轉基因小鼠，兩種子代小鼠進一步交配，繁育更多具備兩種基因型其中之一的小鼠。對于AMPKα1fl/fl/Csf1r-MerCre小鼠，腹腔注射他莫昔芬，激活Cre酶，剪切掉AMPKα1第3外顯子，破壞AMPKα1的基因(Prkaa1)結構，使之無法正常表達。該過程如圖1所示。對照小鼠為AMPKα1fl/fl/WT小鼠。

圖1 轉基因小鼠培育過程

4.小鼠基因型的鑒定 將各雜交繁育階段的4周齡子代小鼠，剪取鼠尾末梢組織，用鼠尾消化液：蛋白酶K為100∶1比例的混合液100 μL浸泡，56℃加熱并間斷振搖使鼠尾組織完全消化溶解，之后85℃加熱40 min變性，提取的DNA溶液進一步進行PCR擴增，擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定分子量大小，從而確定小鼠基因型。用于AMPKα1基因型鑒定的 PCR引物序列為：上游引物5′-CCCACCATCACTCCATCTCT-3′，下游引物 5′-AGCCTGCTTGGCACACTTAT-3′，PCR 條件為：94℃3 min，然后按94℃30秒、62℃30秒、72℃30秒的步驟循環35次，接72℃2 min，10℃保持。用于MerCre基因型鑒定的PCR引物序列為：上游引物5′-AGATGCCAGGACATCAGGAACCTG-3′，下 游 引 物 5′-ATCAGCCACACCAGACACAGAGATC-3′，PCR 條件為：94℃ 1.5 min，然后按94℃30秒、62℃45秒、72℃45秒的步驟循環35次，接72℃2 min，10℃保持。

5.他莫昔芬誘導敲除目的基因 給8周齡的小鼠腹腔注射他莫昔芬溶液(濃度為20 mg/mL，溶于食用玉米油)，每天注射1次，每次注射0.1 mL(即2 mg/d)，連續注射5 d，以誘導Mer-Cre融合蛋白轉入細胞核，剪切目標基因的 loxP位點，敲除AMPKα1基因。在開始注射的第6天開展各項實驗檢測。

6.骨髓細胞AMPKα1基因mRNA表達水平的檢測 8周齡的 AMPKα1fl/fl/Csf1r-MerCre鼠和AMPKα1fl/fl/WT鼠各取6只，連續注射他莫昔芬5 d，在第6天將小鼠使用戊巴比妥鈉麻醉處死后，分離右后肢脛骨，剪開兩端，用1 mL注射器灌注0.9%氯化鈉液沖洗骨髓腔，用Ep管收集沖洗下來的細胞懸液，5 000 rpm離心5 min，棄上清，加1 mL的Trizol裂解骨髓細胞，之后用 0.2 mL氯仿抽提RNA，接著用0.5 mL異丙醇沉淀RNA，再用0.5 mL的75%乙醇清洗RNA沉淀兩遍，最后用15 μL的DEPC水溶解RNA。RNA溶液使用Qubit 3 Fluorometer測定濃度，取 2 μg 總量的 RNA，使用Promega公司逆轉錄試劑盒，按標準反應體系和流程條件反轉錄得到 cDNA。各樣本的 cDNA按SYBR(II)PreMix酶20 μL反應體系條件進行Realtime PCR檢測，得到的Ct值計算 ΔΔ-Ct，用于統計目標RNA水平的組間差異。AMPKα1的引物序列為： 上游 5′-TACTCAACCGGCAGAAGATTCG-3′， 下游 5′-AGACGGCGGCTTT CCTTTT-3′；內參基因 βactin的引物序列為：上游5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′，下游 5′-CCAGT TGGTAACAATGCCAT GT-3′。 Real-time PCR 反應條件為：94℃2 min，然后按94℃5秒、60℃34秒、72℃30秒并拍照熒光信號的步驟反應40個循環，最后10℃保持。

7.小鼠血壓的測定 使用國產森西公司的BP2 010 A系統，將未麻醉的小鼠誘導進拘束籠中，留鼠尾在外。拘束籠放在恒溫套管內，保證37℃恒溫環境。將袖套式血壓探頭套在鼠尾根部，固定位置，待小鼠平靜、血壓監測曲線穩定后，記錄連續五次測定的血壓值，取平均值作為當次的小鼠血壓。首先取8周齡AMPKα1fl/fl/WT鼠10只，隨機分為兩組，其中一組注射他莫昔芬5 d，第6天檢測兩組血壓。再取 8周齡 AMPKα1fl/fl/Csf1r-MerCre鼠 13只，AMPKα1fl/fl/WT鼠10只，均注射他莫昔芬5 d，第6天檢測兩組血壓。

8.統計學方法 統計數據使用Graphpad Prism 5.0軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，計量資料間兩組均數比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.巨噬細胞特異性敲除AMPKα1的轉基因小鼠的基因型鑒定 剪取4周齡小鼠的鼠尾，提取DNA，對目標片段進行PCR擴增后，跑1%濃度瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。代表性結果如圖2所示，2 A為對AMPKα1-loxP片段區域擴增的結果，野生型AMPKα1該區域片段為334 bp，而AMPKα1-loxP片段為450 bp，可見樣本1～5均為純合型AMPKα1-loxP陽性轉基因鼠(AMPKα1fl/fl)；2B為對 Csf1r-Mer-Cre片段區域擴增的結果，該片段為236 bp，可見樣本1、2、5為Cre陽性，而樣本3、4為 Cre陰性。綜合起來，樣本 1、2、5為成功構建的 AMPKα1fl/fl/Csf1r-MerCre小鼠，而樣本 3、4為 AMPKα1fl/fl/WT對照小鼠。

圖2 轉基因小鼠子代基因型鑒定結果 A：AMPKα1-loxP基因片段的條帶；B：Csf1r-Mer-Cre基因片段的條帶

2.PCR檢測他莫昔芬誘導敲除巨噬細胞AMPK的效果 對 AMPKα1fl/fl/Csf1r-MerCre小鼠和AMPKα1fl/fl/WT對照小鼠注射他莫昔芬5 d，提取骨髓細胞RNA，進行Real-time PCR檢測AMPKα1表達水平，結果如圖3所示，可見相比野生型小鼠，AMPKα1敲除鼠的目標基因RNA水平顯著降低，相對表達量只有野生對照的1/2左右[(0.9263±0.1293)vs.(0.47±0.04657)，P ＜0.01]，證明誘導敲除巨噬細胞中的AMPK是成功的。

圖3 Real-time PCR檢測 AMPKα1基因的表達量(與Cre野生型對照鼠相比，?P＜0.01)

3.檢測敲除巨噬細胞AMPKα1對于小鼠基礎血壓的影響 我們首先檢測了他莫昔芬對于基礎血壓的影響，結果如圖4 A所示，可見該藥物腹腔注射對基礎收縮壓的影響很小[Cre野生鼠，不注射 vs.注射，收縮壓(122.9±3.183)vs.(124±6.878)mm-Hg，1 mmHg＝0.133 kPa，P＝0.427]，同時兩組小鼠的舒張壓和體質量差異無統計學意義[不注射 vs.注射，舒張壓(72.48±1.686)vs.(75.86±2.502)mmHg，P＝0.31]；體質量[(25.3±1.02)vs.(25±1.19)g，P＞0.999]。 進一步檢測 AMPKα1敲除鼠和野生型對照鼠在注射他莫昔芬5 d之后，各自的血壓水平，結果如圖4B所示，可見特異性敲除巨噬細胞AMPKα1會導致基礎水平的收縮壓顯著降低(對照鼠 vs敲除鼠[收縮壓(123.5±3.577)vs.(107.5±4.814)mmHg， P＝0.037]，而兩組小鼠的舒張壓和體質量差異無統計學意義[(對照 vs.敲除，舒張壓(74.17±1.53)vs.(70.88±3.61)mmHg，P＝0.17；體質量(5±0.74)vs.(23.86±0.48)g，P＝0.15]。

圖4 檢測不同基因型小鼠的基礎血壓差異 A：Cre野生型小鼠在不注射和注射他莫昔芬條件下的基礎血壓；B：Cre野生型小鼠和Cre陽性小鼠都注射他莫昔芬后的基礎血壓(與Cre野生型對照鼠相比，?P＜0.01)

討 論

高血壓是世界各國共同面對的重大公共衛生疾病之一。以 SBP超過 140 mmHg、DBP超過 90 mmHg為標準，則全球約有10億人患有高血壓[6]。其中西方國家高血壓的發病率高達總人口的1/3，且其發病率隨年齡增加而升高，在70歲左右的人群中約70%有高血壓[2]。我國同樣面臨著高血壓疾病發病率高的問題，2018年初發表的項研究證實，18歲以上人群中，約23.2%的受訪者患有高血壓，另有41.3%的受訪者處于高血壓前期[1]。高血壓容易累及多種臟器，如心臟、腎臟等，導致其損傷和發生纖維化病變，進而引起心梗、血管鈣化、主動脈瘤等諸多疾病[2，7]。這種損傷主要是通過促進炎癥反應而造成的，巨噬細胞等炎癥細胞在其中發揮了重要作用。巨噬細胞按其表型和功能，可分為促進炎癥和纖維化損傷的M1型，以及發揮抗炎作用的M2型，其功能表型可以受所處微環境變化的影響而發生轉變，呈現出很強的可塑性[8]。目前的研究認為，高鹽、血管緊張素AngII等可以促進巨噬細胞分化為M1型、并增加在心臟、腎臟和血管的浸潤，從而促進高血壓的發展和靶器官的損傷[9-11]。此外，還有研究表明，巨噬細胞參與調控鹽離子誘導的血液變化[3]。因此，深入研究巨噬細胞在血壓調控和高血壓狀態下的功能和作用機制，將為高血壓及相關疾病的治療提供新的思路。

一磷酸腺苷激活依賴性蛋白激酶AMPK是調節細胞能量代謝和功能的核心激酶，其催化亞單位(α subunit)在巨噬細胞中主要表達為α1型。既往報道中，AMPK信號通路能夠抑制巨噬細胞的致炎功能，使之更多的表現為抗炎表型[5]。具體機制方面，JAK/STAT信號通路是已知調節巨噬細胞表型分化的幾條信號通路之一[12]，其中 STAT1介導IFNγ的信號，促進巨噬細胞分化為 M1型[12]，STAT3則是被廣泛證實促使巨噬細胞表現為 M2型[13]，而既往報道證實AMPK對STAT1和STAT3均有調控作用[14-15]。因此，AMPK可能通過多種機制，使巨噬細胞在不同微環境條件下分化為不同的表型，進而對血壓調節以及高血壓狀態下的器官損傷產生不同的作用。

鑒于AMPK廣泛存在于各種組織器官細胞中，在心血管系統中發揮著重要的保護作用，如抑制心肌和血管內皮細胞凋亡等等[16-17]。為了避免非特異性敲除AMPK帶來的副作用，并清晰揭示AMPK對于巨噬細胞功能的影響，本研究采用Cre/loxP重組酶系統，通過集落刺激因子的啟動子驅動表達雌激素受體-Cre融合蛋白，保證了在巨噬細胞中特異性表達Cre酶，并在他莫昔芬藥物誘導下將Cre酶定位到細胞核，剪切AMPKα1基因第三外顯子兩端的loxP位點，從而破壞AMPKα1基因結構、實現巨噬細胞特異性的誘導敲除AMPKα1基因。基因型鑒定和RNA鑒定結果都證實了敲除鼠構建成功。在此基礎上，我們證實了這種敲除能夠顯著降低基礎收縮壓，證實敲除巨噬細胞AMPKα1基因對血壓有明顯調節作用。鑒于既往文獻報道，高鹽誘導高血壓條件下，巨噬細胞浸潤到血管外膜，釋放TNF-α，抑制交感神經α2-腎上腺素能自受體的功能，釋放更多的去甲腎上腺素，從而升高血壓[18]；也有文獻報道證實，特定條件下，巨噬細胞會釋放VEGFC，從而降低血壓[3]。而AMPK既可以調節巨噬細胞的表型[5]，又參與調控 VEGF-eNOS等信號通路[19]，因此，敲除AMPK可能影響了巨噬細胞上述兩方面的功能，從而降低血壓。后續的研究工作將從這些方面深入分析巨噬細胞調控血壓的機制。