細胞測溫技術及其在藥物研發中的應用前景

何偉男，嚴森，顧寧

(東南大學生物科學與醫學工程學院，江蘇省生物材料與器件重點實驗室，江蘇 南京 210000)

細胞是生命體結構和功能最基本的單位，可分為原核細胞與真核細胞兩大類[1-2]。以真核細胞為例，細胞核負責合成和儲存DNA[3]。內質網負責合成和運輸蛋白質[4]。線粒體和植物中的葉綠體主要負責產生細胞能量，通過控制水解三磷酸腺苷 (ATP) 來釋放能量[5]，其中部分有ATP參與的生化反應會引起線粒體跨膜電勢的改變，這與細胞內熱的產生密切相關[6-7]。適宜的溫度是細胞生存和發展最基本的條件，由于細胞內各種生化反應的不斷進行，細胞溫度時刻發生變化[8]。細胞的增殖、分化、代謝活動以及病理變化都會引起細胞溫度的波動[9-11]。洞察活細胞溫度變化不僅有助于了解細胞的各種生理活動，而且能夠促進疾病診斷和藥物研發技術的發展。本文從基于發光式細胞測溫和非發光式細胞測溫兩方面對細胞測溫技術進行研究，并對其在藥物研發中的應用進行了展望。

1 細胞溫度

細胞溫度在生命活動中起著重要的作用，這使得細胞測溫技術成為前沿研究課題。細胞溫度相關的研究已經逐漸深入到眾多生命科學研究領域，如圖1所示，近些年所發表的細胞溫度研究的論文涉及了生物化學、生物技術、生理學、藥理學等研究，體現了溫度在細胞生物研究領域的重要性。由于細胞的復雜特性，如何在微納尺度上實現準確穩定的溫度測量，成為目前亟待解決的問題[12]。1994年Kallerhoff團隊[13]通過微量熱量計檢測了細胞群體的溫度變化，通過產熱功率的大小成功地區分出正常組織和癌癥組織。然而不同的組織之間，細胞的形態功能不同，甚至在同一組織中，細胞與細胞之間仍然存在差異 (物質組成差異、結構功能差異、基因表達差異、應急響應模式差異等)。對于細胞群體的分析往往忽略了細胞之間的差異性，進而導致結果的準確性較差。Paulik等[14]利用紅外熱成像技術對單個細胞的產熱過程進行了檢測，但由于細胞的不均勻性和極小尺寸導致紅外熱像儀無法獲取有效的信息。

圖1 細胞測溫應用領域 (數據來源：Web of Science)

以單個細胞作為研究對象，能夠幫助研究者更好地了解細胞之間的差異性，掌握細胞群體中某些特殊的細胞功能。隨著單細胞分析技術的發展，細胞形貌、行為動作、信號轉導、物理性質等均成為研究的熱門。細胞作為研究對象具有以下特點：細胞體積小 (直徑為10～20 μm)、信號微弱、細胞內環境復雜多變以及細胞狀態敏感等。因此，細胞測溫技術需要滿足高靈敏性、高時空分辨率以及抗干擾能力等要求[15]。隨著納米技術的發展，涌現出許多新型有效的測溫技術，包括有機熒光團、量子點、微納熱電偶和一些復合材料等[16-19](見圖2)，Bai課題組[8]和Brites課題組[15]也分別做過細胞測溫技術方面的綜述。在先進技術的支持下，細胞溫度的變化規律逐漸被掌握，尤其是在細胞受到外界刺激時 (光熱刺激[20-22]、藥物刺激[23-24]、離子濃度變化[22,25]等) 產生的溫度變化，有望為藥物研發提供新的研究途徑。

圖2 細胞測溫技術

2 細胞測溫技術

2.1 發光式細胞測溫 光學成像技術一直是探究生物組織和細胞的有力手段，發光式細胞溫度計與現有的成像技術結合使細胞測溫成為可能。非侵入式和不需要接觸測量的優點使其在特定場合得到廣泛使用。隨著納米技術的發展，熒光探針的尺寸已經達到納米尺度。發光式測溫方法可以通過測溫探針的熒光強度、最大發射波長或者熒光壽命變化將細胞溫度實時反映出來[15,26]，具有很好的空間分辨率、溫度分辨率以及數據收集能力。雖然熒光探針在穩定性以及準確性上存在局限，但近年來一直是活細胞熱成像的研究重點。

1941年有機熒光團被發現存在與溫度有關的特性[27]，Huang等[28]以DyLight549熒光團作為溫度計，對靶向于表達TPRV1的細胞膜上特定蛋白的納米顆粒進行溫度監控，在射頻磁場的作用下，MnFe2O4磁性納米顆粒在短短15 s的時間內溫度升高了15 ℃。監測DyLight549熒光團發現，細胞通道的局部產熱觸發了神經元的動作電位，從而激活了細胞的某種行為。該方法有望在不損傷細胞的同時操控細胞行為，為遠程細胞診療提供一種新途徑。Suzuki等[25]利用填充熱敏熒光染料 (Eu-TTA) 的微玻璃管檢測了單個HeLa細胞的產熱，單個HeLa細胞在離子霉素的刺激下導致細胞內外鈣離子濃度變化，從而引起細胞溫度的改變。實驗中通過毒胡蘿卜素抑制了細胞Ca2+-ATPases的功能，添加離子霉素刺激胞內鈣離子流動后，觀察到細胞溫度升高被抑制，這說明在細胞產熱的級聯過程中，Ca2+濃度以及Ca2+-ATPases起著關鍵作用，證實藥物刺激會導致細胞溫度發生變化。隨著熒光探針深入到亞細胞水平上，部分細胞器的溫度傳感器也被設計出來。Homma課題組[29]設計了由兩種羅丹明染料 (Rhodamine B和CS NIR dye) 組成的溫度探針 (Mito-RTP)，探針結合了二者的優點，能夠融入到細胞的線粒體中，同時不受細胞生理環境的干擾。由于Rhodamine B染料的熒光強度對溫度變化有可逆的響應，而CS NIR dye的熒光強度是恒定的，所以通過檢測這兩種染料熒光強度的比值變化，可以實時檢測線粒體的溫度情況。Arai團隊[30]開發了一種選擇性靶向內質網的熒光溫度計 (ER thermo yellow)，溫度靈敏度達到3.9%/℃。該溫度計避免了聚集問題，可以均勻的將目標細胞器染色，并通過改變細胞外部介質的溫度，驗證了結合ER thermo yellow的HeLa細胞的溫度敏感性。對于靶向細胞器的藥物來說，通過觀察溫度變化評估藥物作用效果不失為一種新的觀察視角。Uchiyama團隊[31]致力于研發用于細胞溫度檢測的熒光探針，2011年首次向外公布了單個細胞的溫度圖譜 (見圖3)。通過熒光壽命成像顯微鏡，基于熒光聚合物溫度計的空間分辨率達到200 nm，溫度分辨率在0.18～0.58 ℃之間。觀測單個COS細胞溫度發現，細胞核與中心體的溫度明顯高于細胞質，說明同一個細胞內不同的細胞器之間存在著各自的溫度特性。

圖3 單細胞溫度圖譜

材料本身與溫度相關的特性可用于細胞溫度測量。通過光強變化以及發射峰位移，量子點能夠準確地反映溫度波動。例如Yang等[21]利用量子點的光致發光光譜繪制了Ca2+刺激和冷休克后NIH/3T3細胞內的熱產生，實現了對細胞內部不均勻溫度的直接觀察，有利于實時掌握細胞內信號調控的進程。在雙光子激發下，硒化鎘 (CdSe) 量子點發射光的溫度靈敏度更高，熱成像質量更好，Maestro等[32]成功應用于單個HeLa細胞的溫度測量。與量子點不同，納米級金屬團簇的熒光壽命在生理范圍內會隨著溫度的變化而變化。納米金屬團簇擁有更小的尺寸、良好的生物相容性以及較高的溫度敏感性，同樣也被認為是一種優良的熒光溫度計[33]，常見的主要有金納米團簇[34]、銅納米團簇[35]等。Shang團隊[34]將脂酸包裹的金納米團簇 (AuNCs) 通過內吞作用導入到HeLa細胞中，當改變細胞周圍環境溫度時，來自HeLa細胞內部的AuNCs產生了600～1 000 ns的熒光壽命，并且隨著溫度的升高，熒光壽命明顯降低。基于生物分子如蛋白質[36]和DNA[37-38]的溫度計，能夠準確地嵌入到細胞內部。Donner等[36]將綠色熒光蛋白 (GFP) 作為溫度納米探針，在轉染GFP的癌細胞上進行了測試，利用細胞周圍的金納米棒加熱細胞，檢測熒光偏振各向異性，實現了溫度的實時表征。這種方法為分子生物學的診斷與治療提供了非侵入式的有效工具。

2.2 非發光式細胞測溫 本節主要介紹微納尺度下的溫度測量工具，其溫度特性與發光無直接關系。1986年，Williams和Wickramasinghe發明了一種超高空間分辨率的測溫設備，被稱為掃描熱顯微鏡[39]。掃描熱探針在掃描隧道顯微鏡以及原子力顯微鏡的平臺上得以發揮作用，基于熱電效應及其它物理性質的微納探針可用于檢測物體表面的溫度。Sadat等[40]基于原子力顯微鏡 (AFM)，利用鍍鉑的AFM懸臂創建點接觸熱電偶，將接觸點電壓值與局部溫度聯系起來，擁有小于100 nm的空間分辨率和10 mK的溫度分辨率。Haeberle等[41]改進AFM的懸梁臂，采用焦耳加熱的電阻器提高熱導率測量中的分辨率，通過對脂質體、人體毛發和膠原樣品的熱導率測定，證實了該方法的可行性。隨著氣相沉積以及光刻技術的發展，一些傳統的溫度計實現了納米尺度的溫度觀測。普通K型熱電偶的熱電系數在0.04 mV·℃-1左右，而利用聚焦離子束輔助氣相沉積技術制備的納米金屬熱電偶則具有超高的熱電系數[42]，對鎢鉑納米金屬結表征，其熱電系數為5.4 mV·℃-1，這證實了微納熱電偶作為細胞測溫工具的潛力。Wang等[23]通過電化學腐蝕法將鎢棒腐蝕出納米級別的針尖，利用有機溶劑四氫呋喃溶解聚氨酯，包裹在腐蝕后的鎢棒表面作為絕緣層。利用真空離子濺射儀，在絕緣層上均勻地濺射一層100 nm厚度的金屬鉑層，巧妙地將熱電偶結構集中在納米尺度的針尖上。利用顯微鏡與顯微操作儀，首次實現了鎢鉑熱電偶的單細胞測溫功能。Shrestha團隊[43]為追求低成本，易開發的熱傳感器，改造了玻璃微量吸液管，將低熔點的焊料合金 (Sn) 作為芯材置于玻璃管內，并在管外鍍鎳薄層，最終在玻璃管尖端構建了熱電偶結。通過將制備好的熱電偶插入到視網膜色素上皮細胞中，測量了瞬態的細胞溫度變化。以熱電效應為基礎的測溫工具在溫度分辨率和時間分辨率上表現出極大的優勢，為細胞測溫研究的發展奠定了重要基礎。

Gao等[44]在碳納米管內填充液態鎵制備了新型納米溫度計，其工作原理與水銀溫度計相似，通過觀測液態鎵的熱膨脹來測量溫度。Li等[45]直接將細胞培養在只有2 mm大小的鉑電阻上，利用鉑電阻的溫度敏感性將附著在電阻表面的細胞溫度檢測出來。該測溫裝置增加了信號收發模塊，實現了細胞溫度的無線測量。待測細胞連同測溫裝置一同放進細胞培養箱中，確保待測細胞處于最合適的生存環境。Inomata等[46]開發了一種獨特的測溫方法，利用微流控技術制備了一個只能容納單個細胞通過的流道，當細胞流動到特定位置，細胞產生的熱量會傳遞到一個真空室內，室內的硅諧振熱傳感器會根據溫度的變化而改變諧振器的諧振頻率。該裝置成功應用到單個棕色脂肪細胞的溫度檢測，整個過程持續了20 min。

活細胞本身能夠感知溫度變化，并由此來激活某些蛋白。細胞溫度的傳感是由蛋白質、核酸和mRNAs來完成的，通過修改其構象結構來響應溫度變化[47]。Narberhaus等[48]證實RNA溫度計是細胞中感知溫度的主要方式。RNA溫度計位于RNA結構的某些特定區域，在生理溫度范圍內保護核糖體結合位點的未翻譯區域。當細胞溫度下降，細胞會激活冷休克蛋白的表達。這些mRNA蛋白經過結構重排，在低溫下形成熱力學上更穩定、不易降解的構象，有利于細胞的存活。Shah等[49]計算了不同溫度下RNA結構的分布，比較近100種隨機選擇的mRNA并探究了它們的熱敏特性，建立了一種研究RNA隨溫度變化的新方法。

在過去的研究中，用于細胞內溫度測量的技術得到了發展。隨著人們認知的提高，細胞生物學研究、疾病診斷治療以及藥物研發等領域都對細胞測溫提出了更高的要求。基于發光式的溫度計中，有機熒光物質對細胞生理環境要求高，容易受到光漂白的限制，導致無法長時間檢測溫度；量子點由于自身存在不穩定的毒性，不均一的形態影響發光分布；侵入式的熱電偶雖然精度高，響應速度快，不易受細胞環境干擾，但是此測量方法往往會損壞細胞的完整性；基于生物結構的溫度計，往往選擇性高，不能有效地應用到其他細胞中。因此，細胞測溫技術仍處于初級階段，還需要進一步的探索。

3 基于細胞溫度檢測的藥物研發前景

3.1 藥物篩選 藥物研發是對潛在藥物的識別、發現、設計和合成，必須在實驗室中進行廣泛的表征和生物活性以及安全性的評估測試，然后才能在人體上進行一系列的臨床實驗，最終將所有的實驗信息匯總進行審批。研究表明，藥物研發從發現測試到最終的審批過程平均需要10～15年的時間，這是一個漫長且充滿風險的過程。藥物的發現和開發需要大量的資源和時間，新藥開發的成本也在不斷增加。藥物研發不僅要達到預防和治療疾病的要求，還要在安全性、可靠性等方面提供保障。藥物篩選作為藥物研發階段的關鍵一步，決定著整個研發過程的進展。細胞測溫技術不僅可以快速獲取準確的細胞信息，而且能夠從細胞甚至亞細胞層面提高藥物篩選效率，加快研發進展。

隨著技術的發展和各學科領域之間的相互配合，有效藥物的發現過程變得更加順利。細胞內溫度的變化可以反映細胞在受到內外界刺激下的許多信息。這種新維度的評估方式對于目前的藥物篩選有著重要啟發。事實上細胞之間是存在差異性的，細胞結構、蛋白質合成以及基因的表達均有不同。過去，由于技術水平的限制，樣品分析往往針對細胞群體，導致細胞特異信號的平均化。隨著細胞測溫技術的引入，在單細胞水平上進行信號檢測、藥物篩選成為可能。例如Wang等[23]通過微納熱電偶測量了單個人腦膠質瘤細胞 (U251) 在加入不同抗腫瘤藥物后的溫度變化，其中只有在加入喜樹堿 (CPT) 后，細胞溫度升高了0.5 ℃左右 (見圖4)。相同的結果由Gota團隊[24]在COS7細胞中發現，喜樹堿是DNA拓撲異構酶Ⅰ的抑制劑，在細胞進行DNA復制過程中造成細胞損傷，最終導致細胞死亡。作為細胞周期特異性藥物，喜樹堿對S期階段的細胞具有更明顯的影響，這一特性在溫度檢測中被證實。Zohar團隊[50]利用熱成像技術發現，乙酰膽堿刺激后的細胞可以產生一種被阿托品阻斷的雙相熱波，而阿托品本身可以在細胞中產生單相熱波，表明它與受體的相互作用同時激活了細胞的一些代謝途徑。溫度的變化與藥物的作用機制相對應，因此可以通過對細胞溫度進行監測實現藥物的篩選。

圖4 喜樹堿(CPT)刺激后細胞溫度變化[23]

3.2 藥物分析 在藥物研發過程中，對于藥物的藥代動力學和治療效果的分析評估也至關重要。在藥物研發的初期，通過體外模擬藥物在體內的作用過程，不僅節約了成本而且簡單高效。在藥物分析過程中，為了檢測藥物作用效果以及安全性，需要定量分析藥物在細胞內的吸收、分布以及代謝的規律。然而細胞的生長和分化過程復雜多變，傳統的技術手段不能實時有效地反映藥物作用過程。細胞測溫技術通過監測熱量的方式獲取空間和時間分辨率的信息，實時追蹤特定細胞的信號更新。隨著測量分辨率的進一步提高，藥物在細胞水平上的定位成為可能，這也是目前藥物研究中一個重要的信息缺口，多樣的測溫技術在精準定量分析和追蹤藥物功效方面將會展現出巨大的潛力。隨著技術的革新，細胞測溫技術的分析已經達到亞細胞的水平，可以實現從細胞膜、細胞質、線粒體、內質網以及細胞核等全方位的溫度監控，從而精確監測藥物作用細胞后的動態變化。例如前文介紹的Uchiyama小組[31]通過熒光壽命繪制了單個細胞的溫度分布，可以清晰地觀測到各個細胞器的溫度，證實處于不同活躍狀態的細胞器之間的溫度是不同的，頻繁進行生化反應的場所 (細胞核、線粒體等) 反映出更高的熱量變化。Takei團隊[51]通過特制的比色納米溫度計成功地追蹤到由離子霉素引起的單個細胞的溫度變化。離子霉素是對鈣離子有親和力的離子載體，在細胞中會引起鈣離子濃度改變從而導致細胞溫度變化，不同部位溫度的升高表明細胞內產生了不同程度的熱量 (見圖5)，從溫度視角分析藥代動力學，有助于評估藥物作用的詳細靶點。Inomata團隊[46]探究了去甲腎上腺素對棕色脂肪細胞的影響，刺激后的細胞持續釋放熱量，可用于統計藥物作用的反應時間。Gota團隊[24]和Suzuki團隊[25]等分別嘗試了通過調控細胞代謝產物濃度來改變細胞溫度，相似的藥物作用機理也可以通過細胞溫度改變來逆向推導，有利于藥物功效的準確分析。

圖5 離子霉素誘導下細胞溫度非均勻變化

3.3 治療方案設計 臨床上治療方案的設計直接影響藥物發揮的效果。對于用藥時間、最佳劑量以及給藥間隔的把控在藥物研發中需要得到足夠的重視。通過體外細胞模擬測試，可以方便的探究最佳的用藥條件。為了更加有效地治療，相比于大規模的臨床實驗，治療應針對于個別病例，甚至精準到個別病變組織。針對性的細胞溫度-給藥模型能夠提供相關疾病的詳細熱力學信息，從而改進個性化醫療，促進精準治療的發展。細胞熱量的變化程度與藥物作用效果聯系起來，是一種新的定量分析手段。為探究炎癥發生機制以及炎癥治療的最佳給藥濃度，Li等[52]在體外培養了人微血管內皮細胞 (HMEC-1)，利用內毒素 (LPS) 刺激人微血管內皮細胞 (HMEC-1) 來觸發炎癥反應，證實當LPS濃度為0.1 mg·L-1時，炎癥效果最明顯，此時內皮細胞所表達的溫度變化也最強烈。接著，他們以同樣的方式檢測發現去甲腎上腺素在1 μmg·L-1濃度下炎癥修復效果最好，證實了藥物在發揮最佳功效時存在合理的濃度范圍 (見圖6)。細胞的產熱過程與細胞活動有著密切聯系，細胞溫度變化程度可以作為評估標準，用于分析各種細胞生理活動。通過細胞溫度-給藥模型的建立，將有助于制定合理有效的臨床治療方案。

圖6 不同濃度藥物對細胞溫度影響[52]

此外，通過檢測癌細胞對溫度刺激的反饋信息也是改進治療方案的有效手段。Yang等[21]利用量子點監控了細胞受到冷刺激下的溫度變化，證實活細胞對冷刺激有一定的應激抵御能力。Bendix等[53]直接測量了細胞磷脂雙分子層的溫度，實現了對溫度升高過程的精確控制。在癌癥熱療技術中，當腫瘤細胞被加熱超過40 ℃時即可被殺死，但正常細胞與腫瘤細胞交替混合，需要實現精確的局部靶向加熱。Kucsko團隊[54]將局部光致熱源納米金顆粒與敏感的納米尺度溫度計金剛石納米晶體 (Nanodiamonds) 結合在一起，實現了對腫瘤細胞的精準定位以及對局部細胞溫度的實時監控，測量并調控了亞細胞結構的產熱梯度，實現了在不損傷周圍細胞的同時識別并殺死腫瘤細胞。因此，靈活多樣的細胞測溫技術為臨床疾病的治療提供了更多的解決方案。

4 結語

本文總結了一些具有代表性的測溫技術及其在細胞生物領域的相關應用，可以預見細胞測溫技術在藥物研發領域有著廣闊的前景，通過結合生物手段，細胞測溫技術將能夠應用到藥物靶向、藥物緩釋、新藥開發等領域。目前，細胞測溫技術正處在一個發展的階段，隨著微納加工技術的不斷進步，細胞測溫領域未來的趨勢必將是多學科的結合應用，例如材料設計、熱力學、納米技術、微電子學以及生物醫學等。在后續的研究中，我們需要持續關注細胞測溫的技術革新，提高測溫裝置的性能，追求多種測溫手段的相互結合。在生物應用中，我們要深入發掘細胞溫度所蘊含的生物信息，推動藥物篩選、藥物分析以及治療方案設計等多個方面的發展，從而加快新藥研發的進程。在多學科領域的配合下，細胞測溫技術必將成為細胞生物學或生命科學發展的有力工具。