HPLC測定維格列汀中的2種基因毒性雜質

吳文惠，王少卿

(1.山東中醫藥大學 藥學院，山東 濟南 250355；2.煙臺萬潤藥業有限公司，山東 煙臺 264006)

維格列汀(vildagliptin)，化學名：1-[(3-羥基-金剛烷基-1-氨基)乙酰基]-吡咯烷-2(S)-甲腈[1-[(3-Hydroxy-adamant-1-ylamino)acetyl]-pyrrolidine-2(S)-carbonitrile]，是諾華公司開發的二肽基酶Ⅳ(dipeptidyl peptidaseⅣ,DPP-Ⅳ)抑制劑[1]，用于2型糖尿病的治療，具有選擇性高、競爭性強、可逆性高的特點[2]。維格列汀合成中間體(S)-1-(2-氯乙酰氯)吡咯烷-2-甲酰胺(VGN-A)和(S)-1-(2-氯乙酰氯)吡咯烷-2-甲腈(VGN-B)具有基因毒性警示結構[3]。本文首次建立了測定維格列汀中潛在基因毒性雜質的有效方法。基因毒性雜質可根據毒理學關注閾值(threshold of toxicological concern，TTC)來設定限度[4]。TTC值是每人每天攝入限量1.5μg[5]。維格列汀的最大日劑量為100 mg，根據TTC 值限定其基因毒性雜質的含量不得超過0.0015%。

1 儀器與試藥

島津LC-10AT高效液相色譜儀(紫外檢測器)、維格列汀原料藥(煙臺萬潤藥業有限公司，批號：VPVGN14001、VPVGN14002)；維格列汀對照品(KQRG1707191批，99.7%)；VGN-A對照品(KQLei1706242-2批，99.48%)；VGN-B對照品(KQLei1706241-2批，99.85%)；乙腈為色譜純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相A為辛烷磺酸鈉溶液(取辛烷磺酸鈉2.1 g，加水溶解并稀釋至1000 mL，用磷酸調節pH值至2.1)；流動相B為乙腈，梯度洗脫(程序見表1)，檢測波長210 nm；流速1.0 mL·min-1；進樣體積20 μL；柱溫30℃。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液的配制

精密稱取維格列汀原料藥約200 mg，置10 mL量瓶中，加流動相A-乙腈(80∶20)溶解并定容，得20 mg·mL-1供試品溶液。精密稱取維格列汀對照品約3 mg，置100 mL量瓶中，加流動相A-乙腈(80∶20)溶解并定容，得30 μg·mL-1維格列汀對照品貯備液，將其定量稀釋10倍，得維格列汀對照品溶液。精密稱取VGN-A對照品約3 mg，置100 mL量瓶中，加流動相A-乙腈(80∶20)溶解并定容，得30 μg·mL-1VGN-A對照品貯備液，將其定量稀釋10倍，得VGN-A對照品溶液。精密稱取VGN-B對照品約3 mg，置100 mL量瓶中，加流動相A-乙腈(80∶20)溶解并定容，得30 μg·mL-1VGN-B對照品貯備液，將其定量稀釋10倍，得VGN-B對照品溶液。精密量取維格列汀對照品儲備液、VGN-A對照品儲備液和VGN-B對照品儲備液各10 mL，置100 mL量瓶中，加流動相A-乙腈(80∶20)溶解并定容，得約含維格列汀、VGN-A、VGN-B各3 μg·mL-1的系統適用性溶液。

2.3 專屬性實驗與系統適用性實驗

分別取空白溶劑流動相A-乙腈(80∶20)、維格列汀對照品溶液、VGN-A溶液、VGN-B溶液、系統適用性溶液，在“2.1”項的色譜條件下測定，維格列汀、VGN-A、VGN-B的定位圖譜見圖1～3。結果顯示：溶劑峰不干擾測定(見圖4)，維格列汀峰與VGN-A峰和VGN-B峰的分離度均大于3.0(見表2，圖5) ，專屬性好。

表2 系統適用性溶液色譜圖中各色譜峰的保留時間和分離度

圖1 VGN-A

圖3 維格列汀

圖4 溶劑

圖5 系統適用性溶液

2.4 重復性、中間精密度與溶液穩定性實驗

取VPVGN14001批供試品溶液，在“2.1”項的色譜條件下連續進樣6次。未檢出VGN-A，計算得VGN-B的RSD=5.75%，表明方法的重復性好；同法配制供試品溶液，兩名分析人員平行測定6次，未檢出VGN-A，計算得VGN-B的RSD=9.44%，表明方法的精密度符合要求。取VPVGN14002批供試品溶液，分別在0、140、280、420、560、700、840 min進樣20 μL，VGN-A和VGN-B均未檢出，維格列汀峰面積的RSD=0.87%，表明供試品溶液室溫放置14 h穩定。

2.5 耐用性實驗

在“2.1”項的色譜條件下，改變柱溫(25℃、35℃)、流速(0.8 mL· min-1、1.2 mL· min-1)、流動相A的pH值(1.9、2.3)以及兩種不同品牌C18色譜柱，進行耐用性試驗的考察，結果見表3。結果顯示：當改變以上系統條件時，系統適用性溶液色譜圖中維格列汀峰與VGN-A峰和VGN-B峰的分離度均大于3.0，符合系統適應性試驗要求。

表3 不同色譜條件下系統適用性溶液色譜圖中各色譜峰的保留時間和分離度

2.6 檢測限和定量限

取“2.2”項的VGN-A對照品貯備液、VGN-B對照品貯備液，加流動相A-乙腈(80∶20)稀釋成不同質量濃度的溶液，按“2.1”項下的色譜條件進樣20 μL，記錄色譜圖，根據 3 倍噪音計算系統對樣品的檢測限、10 倍噪音計算系統對樣品的定量限。VGN-A、VGN-B的檢測限溶液的質量濃度分別為0.004533 μg·mL-1、0.004763 μg·mL-1，檢測限分別為0.091 ng、0.095 ng；定量限溶液的質量濃度分別為0.01511 μg·mL-1、0.01429 μg·mL-1，定量限分別為0.030 ng、0.029 ng。

2.7 線性和范圍

精密量取“2.2”項的VGN-A貯備液、VGN-B貯備液，分別用流動相A-乙腈(80∶20)逐級稀釋，配置成一系列質量濃度的線性溶液，分別進樣20 μL，記錄色譜圖。以峰面積Y對樣品質量濃度X作線性回歸，結果見表4。結果表明VGN-A、VGN-B的質量濃度與峰面積線性關系良好。

表4 線性范圍考察結果

2.8 加樣回收率

精密稱取供試品9份，每份約200 mg，置10 mL量瓶中，每組3份分別平行加入高、中、低三種體積的VGN-A對照品貯備液、VGN-B對照品貯備液，用流動相A-乙腈(80∶20)定容，分別進樣，按外標法以維格列汀峰面積計算VGN-A、VGN-B的含量和回收率。VGN-A、VGN-B的平均回收率分別為99.0%、93.2%，RSD分別為4.7%、5.4%，符合定量分析的要求。

3 討論

藥物中基因毒性雜質的檢測靈敏度和選擇性要求高，常規的HPLC或GC方法一般達不到檢測藥物中痕量基因毒性雜質的靈敏度要求，多選用液質聯用技術或氣質聯用技術進行測定[3]。本文采用常規的HPLC法，在相關參考文獻[6]基礎上優化了梯度洗脫的程序，VGN-A、VGN-B的檢測限分別為0.004533 μg·mL-1、0.004763 μg·mL-1，定量限分別為0.01511、0.01429 μg·mL-1，靈敏度顯著提高，兩個雜質的定量限和檢測限均顯著低于雜質限度(0.3 μg·mL-1)，能滿足基因毒性雜質的檢測要求。該方法下兩雜質與主峰的分離度均大于3.0，確保了該方法的專屬性。本實驗從專屬性和系統適用性、溶液穩定性、耐用性、加樣回收率、線性和范圍、重復性與中間精密度、檢測限和定量限等方面進行了分析方法驗證，為檢測兩種潛在基因毒性雜質VGN-A和VGN-B的含量提供了可靠性依據，且該方法操作簡單，不需聯用質譜即可對基因毒性雜質進行高靈敏度的可靠測定。