一種新型苯基四氮唑類化合物的合成及應(yīng)用研究

池彥偉，汪貞貞

(河南師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007)

吲哚胺-2,3-雙加氧酶1(IDO-1)是一類存在于機(jī)體內(nèi)的天然免疫調(diào)節(jié)酶，與同工酶吲哚胺-2,3-雙加氧酶2(IDO-2)、色氨酸-2,3-雙加氧酶(TDO)共同組成IDO家族。人的IDO1由403個氨基酸殘基所組成，相對分子質(zhì)量約42000，其基因位于8號染色體，長約15kb，包括10個外顯子和9個內(nèi)含子，為單拷貝基因。IDO1廣泛分布于肝外組織，主要見于次級淋巴器官和胸腺髓質(zhì)內(nèi)，并散布于附睪、胎盤、胃腸道黏膜及眼前房等免疫豁免組織中。IDO1在成纖維細(xì)胞、B細(xì)胞等多種細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)，但是表達(dá)量最高的細(xì)胞為抗原提呈細(xì)胞，如樹突細(xì)胞核巨噬細(xì)胞[1-2]。

IDO1的生理學(xué)功能即是通過調(diào)節(jié)色氨酸及其代謝產(chǎn)物的濃度實(shí)現(xiàn)。如：色氨酸耗竭，可(1)抑制致死性免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生，(2)抑制細(xì)菌、病毒及寄生蟲生長，(3)減少蛋白質(zhì)及5-羥色胺的生物合成，(4)抑制T細(xì)胞增殖分化。又如，代謝產(chǎn)生的免疫活性犬尿氨酸可促進(jìn)免疫反應(yīng)，維持免疫自穩(wěn)等[3]。

Muller等研究認(rèn)為IDO1通過抑制T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的功能在微環(huán)境內(nèi)形成免疫抑制狀態(tài)，腫瘤細(xì)胞可以利用這種負(fù)向的免疫調(diào)節(jié)來逃避免疫系統(tǒng)的識別與殺傷，進(jìn)而不斷發(fā)展與轉(zhuǎn)移。IDO1可能通過3種機(jī)制參與誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中的免疫耐受。(1)可以抑制SliT細(xì)胞增殖：IDO在抗原提呈細(xì)胞特別是漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞內(nèi)高度表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞局部的色氨酸耗竭，誘導(dǎo)T細(xì)胞停滯于G1期，進(jìn)而抑制T細(xì)胞的增殖來下調(diào)機(jī)體的免疫能力。(2)促進(jìn)T細(xì)胞凋亡：IDO依賴性的色氨酸降解可以導(dǎo)致犬尿氨酸水平提高，進(jìn)而誘導(dǎo)氧自由基介導(dǎo)T細(xì)胞凋亡。(3)樹突細(xì)胞IDO表達(dá)升高，引起局部色氨酸耗竭，進(jìn)而可以活化和增強(qiáng)調(diào)節(jié)T細(xì)胞的免疫抑制功能，同時抑制效應(yīng)T細(xì)胞的功能，促使機(jī)體對腫瘤特異性抗原免疫耐受[4]。

唑類是一類非常重要的含氮雜環(huán)化合物，具有多種生物活性，廣泛存在于藥物分子中。其中，含有四個氮原子的五元芳雜環(huán)化合物四氮唑，是羧基的生物電子等排體，可用來取代藥物中的羧基以緩解羧基在體內(nèi)引起的不良反應(yīng)，且可大大提高藥物的脂溶性，進(jìn)而增加藥物的生物利用度。此外，四氮唑類化合物具有抗腫瘤、抗菌、抗瘧疾和抗結(jié)核菌等多種生物活性，故近年來這類化合物在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，被科學(xué)家認(rèn)為是最具發(fā)展前景的一類化合物[5-8]。

綜合以上文獻(xiàn)及大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，我們以苯基四氮唑、1,3-二氯丙醇和3,4,5-三甲氧基苯胺為原料，進(jìn)過一步反應(yīng)“一鍋法“合成了一個新型苯基四氮唑類化合物(圖1)，并將該化合物進(jìn)行了IDO1抑制活性測試。

圖1 新型苯基四氮唑化合物的合成路線

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州予華儀器有限公司)；YRE-2020旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州予華儀器有限公司)；酸度計(jì)(梅特勒-托利多)；AV400型核磁共振儀(德國Bruker公司)；LC 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)。

苯基四氮唑(99.5%，阿爾法試劑)；1,3-二氯丙醇(99%，阿拉丁試劑)；3,4,5-三甲氧基苯胺(98%，國藥集團(tuán))；無水氫氧化鋇(99%，國藥集團(tuán))；其余試劑均為市售分析純。

1.2 目標(biāo)化合物的合成

在反應(yīng)瓶中，把苯基四氮唑15 g(0.1 mol)和無水氫氧化鋇34 g(0.2 mol)加入N,N-二甲基甲酰胺200 mL中，在室溫條件下攪拌20 min，然后在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，緩慢滴加溶有1,3-二氯丙醇13 g(0.1 mol)的N,N-二甲基甲酰胺50 mL，滴加完后室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1 h，然后再緩慢滴加溶有3,4,5-三甲氧基苯胺18 g(0.1 mol)的N,N-二甲基甲酰胺70 mL，緩慢加熱至65℃，反應(yīng)9 h后TLC監(jiān)控原料反應(yīng)完全，把反應(yīng)液倒入水300 mL中，用稀鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值為6，再用乙酸乙酯100 mL萃取反應(yīng)多次，合并有機(jī)相，濃縮后得到目標(biāo)化合物 35 g，收率為90%；1H NMR (400 MHz，DMSO-d6)：8.09 (d, J=8.0Hz, 2H), 7.51 (dd, J1=8.0Hz, J2=8.0Hz, 2H), 6.77 (d, J=4.0Hz, 2H), 4.89 (dd, J1=4.0Hz, J2=8.0Hz, 1H), 4.78 (dd, J1=4.0Hz, J2=4.0Hz, 1H), 4.55(s, 1H), 3.82 (s, 6H), 3.68(s, 3H), 3.57 (d, J=4.0Hz, 1H), 3.39 (t, J1=8.0Hz, J2=8.0Hz, 1H)。

2 結(jié)果與討論

2.1 堿性化合物種類對目標(biāo)化合物收率的影響

本反應(yīng)主要進(jìn)行的是不同結(jié)構(gòu)上的NH與氯代烷的取代反應(yīng)，因?yàn)闀梢环肿拥腍Cl，因此需要在堿性環(huán)境下進(jìn)行反應(yīng)，針對四氮唑環(huán)和苯胺的結(jié)構(gòu)不同，如果需要同時發(fā)生反應(yīng)需要對堿性化合物要求比較高，因此我們在其他反應(yīng)條件不變的前提下對堿性化合物的種類進(jìn)行了篩選。

表1 堿性化合物的種類對產(chǎn)品收率的影響

由表1可以看出，在其他反應(yīng)條件不變的前提下，使用氫氧化鋇作為該反應(yīng)的堿性化合物反應(yīng)效果最好，能夠達(dá)到90%，主要原因可能是因?yàn)橄嗤枖?shù)量的氫氧化鋇能夠提供更多的堿性離子，提高反應(yīng)液堿性強(qiáng)度，有利于反應(yīng)的進(jìn)行。

2.2 反應(yīng)溫度對反應(yīng)收率的影響

由于苯基四氮唑上面的NH活潑型不是很好，因此在和氯代烷發(fā)生取代的時候，需要對反應(yīng)體系進(jìn)行加熱，進(jìn)而提高反應(yīng)物的活化能，反應(yīng)溫度對反應(yīng)產(chǎn)物收率的影響比較大，因此我們在其他條件下不變的前提下，對反應(yīng)溫度進(jìn)行了研究。

表2 反應(yīng)溫度對反應(yīng)收率的影響

由表2可知，在保持其他反應(yīng)條件不變的前提下，隨著反應(yīng)溫度的提高，目標(biāo)化合物的反應(yīng)收率逐漸升高，當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到65℃時，收率達(dá)到90%，繼續(xù)升高溫度，反應(yīng)副產(chǎn)物增多，導(dǎo)致反應(yīng)收率降低。

2.3 反應(yīng)時間對反應(yīng)收率的影響

表3 反應(yīng)時間對反應(yīng)收率的影響

由于該反應(yīng)使用的原料1,3-二氯丙醇，含有活潑的羥基，在堿性環(huán)境下如果反應(yīng)的時間過長，會有副產(chǎn)物出現(xiàn)，因此我們對反應(yīng)時間進(jìn)行優(yōu)化。

由表3可以看出，在保持其他反應(yīng)條件不變的前提下，隨著反應(yīng)時間的增加，反應(yīng)收率逐漸提高，當(dāng)反應(yīng)時間達(dá)到9 h時，反應(yīng)收率最高達(dá)到90%，繼續(xù)增加反應(yīng)時間，反應(yīng)收率降低，因此反應(yīng)時間9 h為最佳反應(yīng)時間。

3 IDO1酶活測試

將Hela細(xì)胞以每孔40000個細(xì)胞的數(shù)目鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)5～6 h，加入稀釋好的待測化合物和終濃度為100 ng/mg重組人源干擾素γ激活I(lǐng)DO1表達(dá)。細(xì)胞于富含5%二氧化碳的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h后，用5%三氯乙酸終止反應(yīng)，并于50℃孵育30 min。細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)沉淀后，取上清液送LC/MS檢測其中的犬尿氨酸含量。根據(jù)XLfit5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，檢測到目標(biāo)化合物IC50為35 μmol/L。

4 結(jié)論

本文以苯基四氮唑、1,3-二氯丙醇和3,4,5-三甲氧基苯胺為原料，進(jìn)過一步反應(yīng)“一鍋法”合成了一個新型苯基四氮唑類化合物，并對合成條件進(jìn)行了優(yōu)化篩選，最后發(fā)現(xiàn)使用氫氧化鋇作為堿性化合物，在65℃條件下反應(yīng)9 h，能夠使反應(yīng)收率達(dá)到90%；最后將該化合物進(jìn)行了IDO1抑制活性測試，該化合物表現(xiàn)出一定的抑制效果，IC50為35 μmol/L，可為進(jìn)一步研究提供重要參考。