反芻動物亞急性瘤胃酸中毒的易感性因素及生物標記物研究進展

張智安，牛驍麟，李 飛，李發弟,2

（1. 草地農業生態系統國家重點實驗室 / 蘭州大學農業農村部草牧業創新重點實驗室 / 蘭州大學草地農業科技學院，甘肅 蘭州 730030；2. 甘肅省肉羊繁育生物技術工程實驗室，甘肅 民勤 733300）

SARA (subacute ruminal acidosis)是由于反芻動物采食過量易發酵碳水化合物后瘤胃內產生大量揮發性脂肪酸，過量酸不能及時被吸收或中和，導致瘤胃pH維持在5.2～5.8并超過3 h而引起的一種營養代謝性疾病[1]。隨著現代集約化生產發展，增加日糧谷物及易發酵碳水化合物的比例是提高反芻動物生產效率的重要手段，該方法在滿足反芻動物能量需求的同時亦增加其患SARA等營養代謝疾病的風險。該疾病對動物瘤胃健康、利用年限及經濟效益造成巨大負面影響。據報道，北美地區每年因SARA最多可損失約10億美元，我國眾多農場也深受其害[2-4]。研究表明，SARA會導致機體干物質采食量(dry matter intake, DMI)、乳脂及乳蛋白含量等顯著降低(P ＜ 0.05)[5]，并增加肝膿腫、腹瀉、蹄葉炎等營養代謝疾病的患病機率[6-8]。該疾病具有隱蔽性，在群體養殖中不易被發覺[9]，對動物飼養管理造成一定難度。沈泰鈺[10]研究發現，患SARA奶牛首次發情天數、產犢間隔、初配天數等指標均顯著高于健康奶牛(P ＜ 0.01)，且DMI減少，患瘤胃炎-肝膿腫-蹄葉炎綜合征的風險大幅增加。即使遺傳背景一致、飼養管理方式相同的反芻動物(奶牛、肉牛及綿羊)在飼喂相同日糧后，其個體對SARA的易感性仍存在明顯差異[11]，該差異會對反芻動物生產性能和瘤胃健康產生不同影響(表1)。因此，有必要尋找能衡量SARA易感性的標志物。但目前關于篩選和衡量SARA風險與易感性的生物標志物研究報道較少，相關數據還不完善[12,15]，需要進一步的研究。

1 反芻動物SARA易感性差異及其影響因素

飼養管理條件一致，飼喂相同日糧的肉牛[17]、綿羊[18]及奶牛[19]，其個體間瘤胃pH、患SARA的風險卻存在明顯差異[20-21]。Khiaosa-ard等[16]以18頭西門塔爾牛為研究對象，飼喂精粗比為60∶40的日糧，持續監測瘤胃動態pH變化5周，結果表明，與耐受組奶牛相比，易感組瘤胃pH ＜ 6.0持續時間顯著增加(P ＜ 0.01)。Gao等[12]給16頭荷斯坦奶牛飼喂精粗比為65∶35的日糧，結果發現奶牛最低pH差異較大，范圍為5.16～6.04；酸中毒指數也存在較大差異，范圍為0.0～10.9。目前關于SARA的定義主要基于瘤胃pH，而瘤胃pH主要通過瘤胃中酸的產生和移除共同作用來確定，瘤胃中酸的移除途徑主要有唾液中和(咀嚼)、流向后腸道的速率(挑食)、瘤胃上皮細胞吸收(吸收功能)等[22-23]。大量研究表明，SARA的發生與動物咀嚼行為、挑食行為及瘤胃上皮吸收功能等息息相關，與SARA高風險動物相比，采食同一日糧后，低風險動物機體唾液分泌量更多、飼料產酸潛力較小、瘤胃酸移除速率更快[14,18,24-25]，其主要機制如圖1所示。

表 1 SARA易感性差異對反芻動物采食行為、泌乳行為和微生物區系的影響Table 1 Effect of SARA susceptibility differences on feeding behavior, lactation behavior, and microflora of ruminants

1.1 咀嚼行為

咀嚼行為與SARA密切相關[14]，咀嚼可以促進動物機體分泌唾液，唾液分泌量是闡釋酸中毒發生差異的關鍵因素[16,26]。研究發現，唾液中含有碳酸氫鹽和磷酸鹽，能有效中和反芻動物因采食易發酵日糧后瘤胃中產生的大量有機酸，約37%的質子可以通過唾液中和[23]。這表明咀嚼行為能影響動物患SARA的風險。Khiaosa-ard等[16]選用西門塔爾育肥肉牛為研究對象，飼喂精粗比為60∶40的日糧，結果表明易感組奶牛采食每千克日糧所用的咀嚼時間 (50.5 min·kg-1)比耐受組更長 (39.5 min·kg-1)。同時，在Gao等[12]的研究中給奶牛飼喂65%精料和35%粗飼料的日糧，研究表明，耐受組奶牛總咀嚼時間為768 min·d-1，而易感組奶?？偩捉罆r間為830 min·d-1。奶牛對瘤胃pH的降低具有適應性反應，SARA易感性奶牛瘤胃內pH較低，此時奶牛會通過增加咀嚼時間來增加唾液分泌或增加來自瘤胃的微粒和液體運動來緩解瘤胃pH的降低[27-29]。通常情況下，瘤胃pH保持在正常生理范圍內，如果攝入過量易發酵碳水化合物，大量揮發性脂肪酸(VFA)及乳酸在瘤胃聚集，機體的調節能力無法再有效維持瘤胃pH平衡，增加SARA的患病風險[30]。

1.2 挑食行為

反芻動物飼養管理過程中，由于動物對日糧成分的喜食程度不同，從而導致機體產生挑食行為。對TMR的過度挑食會增加易發酵碳水化合物過量攝入而減少物理有效中性洗滌纖維(peNDF)攝入，導致瘤胃中VFA大量產生并累積，同時咀嚼行為減少，不能及時中和瘤胃中產生的過多有機酸，增加動物患SARA的風險[31]。Devries等[32]發現，當奶牛泌乳早期飼喂精粗比為55∶45日糧時，它們的挑食行為與瘤胃pH有關：奶牛挑食中等和短粒徑飼料越多，其最高、最低和平均瘤胃pH就越小。還有研究發現，SARA耐受型和易感型奶牛都喜食中、短粒徑飼料，但易感奶牛挑食程度更嚴重(挑食指數 = 105 vs. 102； P = 0.05)。此外，易感奶牛有拒絕采食長粒徑飼料的行為，而耐受奶牛沒有這一行為 (挑食指數 = 87.6 vs. 97.9； P = 0.05)[13]。先前大量研究表明，即使飼喂全混合日糧，動物也會選擇性地采食喜愛的日糧成分[33-35]，當瘤胃pH較低時，動物通常會通過采食一定長粒徑飼料來滿足其對peNDF的需求[36-37]。過度挑食中、短粒徑飼料會增加動物對易發酵碳水化合物的攝入，減少peNDF的采食，急劇增加瘤胃中酸的產生[37]，從而提高患SARA的風險。以上研究表明，挑食行為是導致SARA變異性的因素之一。

圖 1 同一日糧條件下引發SARA敏感性差異的因素及其主要途徑[13, 23-25]Figure 1 Factors causing differences in SARA sensitivity and main pathways under the same diet conditions[13, 23-25]AR: 代表耐受型動物；AS: 代表易感型動物；↑表示顯著增加；↓表示顯著降低。AR: tolerant animal； AS: susceptible animal； ↑: increase significantly； ↓ : decrease significantly.

1.3 瘤胃上皮吸收功能

瘤胃是反芻動物前胃系統中最大的組成部分，瘤胃產生的有機酸能夠為機體提供65%～75%能量[19]，而瘤胃中產生的中短鏈脂肪酸主要通過瘤胃上皮吸收來移除[38]，可以移除瘤胃中約53%的有機酸[23]。因此，瘤胃上皮的吸收能力對維持瘤胃內環境的穩定至關重要。瘤胃上皮為多層鱗片狀結構[39]，從黏膜層到漿膜層依次為顆粒層、角質層、基底層和棘突層。研究表明，SARA會導致動物瘤胃上皮角質化不全，細胞間緊密連接程度降低，細胞間通透性增加，在瘤胃內產生大量內毒素，對機體造成炎癥反應，最終影響動物生產性能[40-41]。盡管管理條件及飼喂日糧組成都保持相同，但不同SARA易感性動物瘤胃上皮對VFA的吸收能力卻存在很大差異[18]。Gregory等[18]通過給成年綿羊灌注葡萄糖誘導SARA，結果發現耐受組與易感組綿羊相比，前者吸收乙酸和丁酸更多，其他VFA含量之間變化很小，總VFA含量耐受組數值上要低于耐受組，說明耐受組對VFA有著更強的吸收能力。另外有研究表明，瘤胃pH的下降常常會伴隨著瘤胃上皮一些相關基因的改變[42-43]，如瘤胃上皮炎癥、H+轉運、VFA吸收及代謝相關基因會隨著pH的改變而發生相應的變化。張瑞陽等[44]通過體外發酵技術，以裝有瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛(n =4)為研究對象，對動物進行間歇性SARA誘導試驗，結果表明，飼喂高精料日糧奶牛的瘤胃乳頭中炎癥相關基因(IL-1β，IL-2，IL-6和IL-8)的mRNA表達更高。Yan等[45]增加山羊飼喂精料的比例(10%vs. 35%)，結果發現隨著日糧精料的增加，氫離子轉運載體(DRA、PAT1及AE2)、Na+/H+交換載體(NHE1、NHE2及NHE3)及一元羧酸轉運載體(MCT1和MCT4)的mRNA表達量升高，有助于瘤胃酸的移除和VFA的吸收。以上研究表明，瘤胃上皮對瘤胃酸吸收功能的強弱會影響動物患SARA風險大小。但目前關于不同SARA易感性反芻動物之間H+轉移及VFA吸收相關基因表達差異的研究鮮有報道，在瘤胃上皮中的表達位置尚不明確，各基因表達產物是否存在轉運特異性等[46]，因此關于反芻動物瘤胃上皮吸收功能需要更進一步的研究。

2 SARA標志物研究進展

2.1 脂多糖

動物采食過量可發酵碳水化合物后使瘤胃內pH急劇下降，瘤胃微生物區系發生明顯改變，纖維素分解菌對pH較敏感，隨著瘤胃pH的降低纖維素分解菌數量下降，大量革蘭氏陰性菌死亡崩解，內毒素被釋放出來導致瘤胃中以游離脂多糖(LPS)為主的內毒素物質含量增加[47-50]。Khafipour等[51]用紫花苜蓿(Medicago sativa)顆粒飼料對8頭泌乳期荷斯坦奶牛進行6周SARA誘導試驗，結果顯示瘤胃內游離LPS濃度從第1周的42 122 EU·mL-1增加至第 6周的 145 593 EU·mL-1，這表明 SARA與LPS之間存在密切的聯系，隨著誘導時間的增加瘤胃內游離LPS含量增加。Stefanska等[52]以13個牧場共305頭高產奶牛為研究對象，探究SARA對奶牛瘤胃中游離LPS的影響，結果發現與正常奶牛群相比，患SARA奶牛群瘤胃游離LPS濃度較高(43 000 EU·mL-1vs. 32 225 EU·mL-1)。該結果與Gozho等[53]研究結果相一致。此外，由于患SARA動物個體瘤胃內毒素含量較高，會引發黏膜發炎、損傷，瘤胃上皮通透性增加，致使血液中毒素可能也會增加[54-55]。綜上大量研究表明，反芻動物過量采食易發酵日糧導致有機酸聚集，引起反芻動物瘤胃內微生物群落的改變，纖維分解菌在較低pH情況下大量死亡并釋放出LPS，增加動物患SARA的風險，這表明瘤胃中游離LPS的含量可以反映瘤胃中微生物區系的狀況及動物患SARA風險大小。

2.2 奇數碳和支鏈脂肪酸

奇數碳和支鏈脂肪酸(odd-and branched-chain fatty acids, OBCFA) 主要來源于脫離瘤胃細菌的膜脂質，其內源合成量十分有限，主要存在于反芻動物乳脂和脂肪組織中[56]。不同瘤胃細菌OBCFA組成不同，當動物患SARA時瘤胃微生物區系發生改變，造成瘤胃細菌OBCFA以及乳中OBCFA含量不同，可以將其用于瘤胃微生物種群組成、變化及其代謝產物的評估，同時可以作為判別反芻動物患SARA風險大小的標志物[56-57]。瘤胃的纖維分解菌(cellulolytic bacteria)富含奇數異構脂肪酸，淀粉分解菌支鏈脂肪酸含量較少，但直鏈奇數碳脂肪酸或者反式異構脂肪酸含量較高。研究發現，在瘤胃液中不同細菌的種群數量與OBCFA含量的相互關系是有差異的[58]。在劉可園[59]的研究中發現瘤胃十五烷酸(C15∶0)和總奇數碳脂肪酸與用于分析的各種細菌都存在相關關系，瘤胃C15∶0的含量與產琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobacter succinogenes)和白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)種群數量負相關，卻與牛鏈球菌(Streptococcus bovis)的種群數量正相關，這說明瘤胃C15∶0和總奇數脂肪酸可以作為瘤胃細菌種群的一種標記物。此外，瘤胃異構脂肪酸與纖維分解菌的種群數量呈正相關，與淀粉分解菌的種群數量呈負相關，這說明瘤胃異構脂肪酸的含量也具有預測瘤胃細菌數量的潛力[59-61]。Colman等[62]用富含小麥(Triticum aestivum)的高谷物日糧對奶牛進行5周的SARA誘導試驗，在第6周發現奶牛乳脂中OBCFA與動物患病前變化很大。在第4周奶牛乳脂中C15∶0和C17∶0含量開始升高，第5周異構十四烷酸(iso C14∶0)含量顯著降低 (P ＜ 0.05)，反式油酸 (C18∶1trans-10)含量顯著升高(P ＜ 0.05)。因此，可以將C18∶1trans-10、C15:0和C17:0作為瘤胃酸中毒的標記物。

2.3 瘤胃相關微生物數量

瘤胃中纖維分解菌對pH敏感，隨著奶牛日糧精料比例增加，瘤胃中相應微生物構成、密度及多樣性都會發生變化[63-65]，因此推測可以利用瘤胃中主要纖維分解菌含量來判斷發生SARA風險的大小。有研究表明，瘤胃內pH ＜ 6.0時間超過330 min·d-1，纖維分解菌的增殖會受到抑制[66-67]。Nagaraja等[54]也發現，瘤胃中主要纖維分解菌，包括白色瘤胃球菌和黃化瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)，產琥珀酸死狀桿菌和溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)對低瘤胃pH環境是比較敏感的。Plaizier等[68]發現隨著動物日糧精料比例的增加，瘤胃pH降低，同時白色瘤胃球菌、黃化瘤胃球菌、產琥珀酸死狀桿菌和溶纖維丁酸弧菌的含量明顯減少，這說明瘤胃pH降低會使主要纖維分解菌含量減少，相反也可以通過瘤胃中pH敏感細菌含量的變化來反映瘤胃中動態pH狀況。Li等[15]通過給湖羊公羔飼喂相同日糧發現，瘤胃pH、VFA及纖維分解菌之間存在明顯差異，與亞急性瘤胃酸中毒低風險組(LSR)相比，亞急性瘤胃酸中毒高風險(HSR)的羔羊表現出較低的瘤胃pH(P = 0.013)和乙酸鹽與丙酸鹽的(乙丙比)比率(P =0.018)，且具有較高的乳酸濃度(P = 0.035)和丙酸的比例(P = 0.033)。在LSR組中，羔羊瘤胃中擬桿菌、纖維桿菌和變形菌門的相對豐度高于HSR組(P ＜ 0.05)。此外，高精料日糧誘導的SARA會導致瘤胃中淀粉分解菌含量增加[69-70]。在Fernando等[71]的研究中把高粗糧轉換成高精料日糧后，與淀粉分解有關的反芻獸新月單胞菌(Selenomonas ruminantium)、牛鏈球菌(Streptococcus bovis)和普雷沃氏菌(Prevotella brevis)數量增加。還有研究表明，當反芻動物患SARA時瘤胃內乳酸產生菌和乳酸利用菌會增加，而原蟲數量會相應減少[72]。動物對高谷物日糧敏感性的差異是一個值得關注的問題，因為在大規模養殖生產中動物日糧通常是針對群體動物配制，有可能導致易感型個體經歷SARA，導致部分個體生產性能降低，而對其余個體無顯著影響。因此，有必要找到簡易判別反芻動物畜群SARA的標志物，以衡量動物個體患SARA風險大小，并對SARA進行早期預防，這對實現動物最大生產效率是極具重要意義的。

3 結論與展望

反芻動物飼喂同一高精料日糧，由于動物咀嚼行為、挑食行為及瘤胃上皮吸收能力的差異而導致個體患SARA的風險不同。動物采食過量易發酵碳水化合物會導致瘤胃內的細菌數量和OBCFA發生改變，瘤胃內主要纖維分解菌含量(如白色瘤胃球菌、黃化瘤胃球菌、產琥珀酸死狀桿菌和溶纖維丁酸弧 菌)、淀粉分解菌和乳酸菌含量、內毒素及瘤胃中奇數碳和支鏈脂肪酸(包括C18∶1 trans-10、C15∶0和C17∶0)可作為判別動物患SARA風險大小的生物標志物。但目前關于判斷SARA的生物標志物的研究還很少，且研究方法也不太成熟，對SARA生物標志物的研究還需要進一步探索。隨著宏基因組學和代謝組學研究方法的不斷成熟，可以考慮在以后SARA生物標志物的研究中引入這些技術，通過宏基因組學進一步探索反芻動物消化道中還未被發現的微生物，通過代謝組學以動物體內某些小分子代謝產物為研究對象，根據其發生的變化以及能對機體產生的影響來尋找能判別動物患SARA的生物標志物，這對進一步認知生物標志物具有重要的科學意義。