解淀粉芽胞桿菌JNC2搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化

梁艷瓊，吳偉懷，習(xí)金根，李 銳，鄭金龍，黃 興，賀春萍，易克賢

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所 / 農(nóng)業(yè)部熱帶農(nóng)林有害生物入侵檢測(cè)與控制重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室/海南省熱帶農(nóng)業(yè)有害生物檢測(cè)監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 571101）

柱花草(Stylosanthes guianensis)是重要的豆科牧草和飼料植物資源，在全球熱帶、亞熱帶地區(qū)廣泛種植，具有耐酸、耐旱、耐貧瘠等特性，發(fā)展?jié)摿薮骩1]。由膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的柱花草炭疽病是影響柱花草產(chǎn)量的重要病害，該病主要為害葉片、葉柄、花序和莖桿的各個(gè)部位[2]，造成柱花草葉片變黃、壞死脫落，莖桿和葉柄枯萎，花序敗落不結(jié)籽，可致幼苗和成株死亡，牧草、種子產(chǎn)量暴減，甚至絕收，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值嚴(yán)重降低[3]。

防治該病主要的措施是化學(xué)防治和抗病品種的選育，然而抗病品種的培育不僅耗時(shí)長(zhǎng)，且易因病原致病性的分化而喪失抗性，長(zhǎng)期使用化學(xué)藥劑，易導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性，污染環(huán)境及造成農(nóng)藥殘留等問(wèn)題，因此亟待尋求一種更持久、更安全的防治措施。

利用有益微生物抑制其他有害生物的生物防治被認(rèn)為是比較安全和有效的防控措施，近來(lái)已成為植物病害防治研究的焦點(diǎn)。胡進(jìn)玲等[4]篩選獲得對(duì)苜蓿莖點(diǎn)霉(Phoma medicaginis)等9種常見(jiàn)的紫花苜蓿主要病原真菌具有拮抗活性的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)和卡那霉素鏈霉菌(Streptomyces kanamyceticus)兩株菌株。張薇等[5]采用平皿對(duì)峙法從中篩選到3株對(duì)菌核病具有拮抗效果的生防菌，S1和S2菌株抑菌效果最好，抑菌帶超過(guò)1.5 cm。溫室測(cè)定發(fā)現(xiàn)S2菌株對(duì)苜蓿菌核病的生防效果最好，接種病原菌10 d后防效達(dá)67.5%，15 d后為61.7%。本研究從堅(jiān)尼草(Panicum maximum)葉片上分離獲得一株生防細(xì)菌解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) JNC2，對(duì)柱花草炭疽病菌具有較強(qiáng)的拮抗作用。代謝活性物質(zhì)是菌株發(fā)揮拮抗作用的關(guān)鍵因素，而培養(yǎng)條件(培養(yǎng)基、發(fā)酵條件)對(duì)代謝活性物質(zhì)產(chǎn)生具有較大的影響。鑒于此，對(duì)JNC2菌株發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以獲得高產(chǎn)抑菌物質(zhì)，從而提高菌株拮抗能力。

1 材料與方法

1.1 材料

解淀粉芽孢桿菌JNC2：篩選自堅(jiān)尼草葉片上；指示菌：柱花草炭疽病菌(Colletorichum gloeos porioides)，均由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所提供。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基候選配方：

1號(hào)培養(yǎng)基：葡糖糖10 g，蛋白胨5 g，酵母粉1 g，牛肉膏3 g，蒸餾水1 000 mL。

2號(hào)培養(yǎng)基：牛肉浸膏8 g，酵母浸膏5 g，葡萄糖10 g，蒸餾水1 000 mL。

3號(hào)培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL。

4號(hào)培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，牛肉膏5 g，氯化鈉5 g，酵母浸膏5 g，葡萄糖5 g，蒸餾水1 000 mL。

5號(hào)培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，蒸餾水1 000 mL。

6號(hào)培養(yǎng)基：葡糖糖10 g，蛋白胨10 g，KH2PO40.2 g，MgSO40.2 g，蒸餾水1 000 mL。

1.3 方法

1.3.1 JNC2菌株生長(zhǎng)培養(yǎng)基的選擇

在LB平板培養(yǎng)基上劃線活化培養(yǎng)24 h，取1環(huán)，置于LB培養(yǎng)液中200 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h，按照1%的接種量分別接入上述幾種培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)24 h，以菌體OD600值和發(fā)酵濾液抑菌活性為指標(biāo)檢測(cè)JNC2菌株的最適培養(yǎng)基。

1.3.2 優(yōu)化培養(yǎng)基的確定

通過(guò)1.3.1篩選獲得的最佳生長(zhǎng)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，通過(guò)單因子(碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽)和正交試驗(yàn)篩選JNC2的優(yōu)選培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。

碳源：在LB培養(yǎng)基中原有成分不變的前提下，以1%的蔗糖、木糖、果糖、可溶性淀粉、麥芽糖、甘露醇、淀粉、乳糖、山梨醇和葡萄糖為碳源，于37 ℃、200 r·min-1的搖床培養(yǎng) 24 h，測(cè)定其 OD600和發(fā)酵濾液抑菌活性。

氮源：共10種，原培養(yǎng)基中的蛋白胨，用1%酵母浸出粉、酵母粉∶胰蛋白胨為1∶1、酵母粉∶胰蛋白胨∶氯化銨為2∶2∶1 (質(zhì)量比)、酵母粉∶胰蛋白胨∶硝酸銨為2∶2∶1 (質(zhì)量比)、牛肉膏、麩皮、尿素、硝酸銨、氯化銨9種氮源替換培養(yǎng)基中的氮源，于37 ℃、200 r·min-1的搖床培養(yǎng)24 h，測(cè)定其OD600和發(fā)酵濾液抑菌活性。

無(wú)機(jī)鹽：分別按0.1% (V/V)含量添加KH2PO4、FeSO4、 ZnSO4、 NaCl、 MnSO4、 MgSO4、 CaCl2以及不添加無(wú)機(jī)鹽離子的空白對(duì)照，替代生長(zhǎng)最佳培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽，其他條件同上。

培養(yǎng)基成分優(yōu)化：根據(jù)碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽的篩選結(jié)果，選用5因素4水平L16(45)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定培養(yǎng)基各成分的最適配比，從而確定適宜JNC2菌株生長(zhǎng)的最佳組合。

1.3.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

在JNC2菌株培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎(chǔ)上，對(duì)搖瓶發(fā)酵的培養(yǎng)溫度、初始pH、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時(shí)間、最佳接種量、裝液量等因素進(jìn)行優(yōu)化。每個(gè)試驗(yàn)組進(jìn)行3次重復(fù)處理，在其他條件不變的情況下進(jìn)行單個(gè)因素優(yōu)化，測(cè)定菌體濃度和發(fā)酵濾液抑菌活性。

培養(yǎng)溫度：按1%接種量將JNC2種子液接入裝有100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，分 別 在 10、 15、 20、 24、 26、 28、 30、 32、 34、37 和 40 ℃，200 r·min-1條件下培養(yǎng) 24 h，以接菌前培養(yǎng)基為空白對(duì)照，測(cè)定其OD600和發(fā)酵濾液抑菌活性。

初始pH：利用HCl和NaOH將優(yōu)化培養(yǎng)基的pH調(diào)至 4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0，按1%接種量將JNC2種子液接入不同pH的培養(yǎng)液中，于37 ℃、200 r·min-1的搖床培養(yǎng)24 h，測(cè)定OD600值和發(fā)酵濾液抑菌活性。

培養(yǎng)轉(zhuǎn)速：將JNC2種子液按1%接種量接入裝有100 mL優(yōu)化培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，將搖床轉(zhuǎn)速分別設(shè)置120、140、160、180、200、220和240 r·min-1，在37 ℃培養(yǎng)24 h，以接種前培養(yǎng)基為空白對(duì)照，測(cè)定OD600和發(fā)酵濾液抑菌活性。

培養(yǎng)時(shí)間：將JNC2種子液按1%接種量接入裝有100 mL優(yōu)化培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 ℃、200 r·min-1培養(yǎng) 12、24、36、48、60、72、84、96、120 h，以接種前培養(yǎng)基為空白對(duì)照，測(cè)定OD600和發(fā)酵濾液抑菌活性。

最佳接種量：250 mL三角瓶中裝優(yōu)化培養(yǎng)基為100 mL，將JNC2種子液的接種量(V/V)分別調(diào)節(jié)為1%、3%、5%、7%、9%，于37 ℃、200 r·min-1條件下培養(yǎng)24 h，測(cè)定OD600和發(fā)酵濾液抑菌活性。

裝液量：將JNC2菌株種子液分別接入裝有20、40、60、80、100、120、140和 160 mL 發(fā)酵液的250 mL三角瓶中，于37 ℃、200 r·min-1條件下培養(yǎng)24 h，測(cè)定OD600和發(fā)酵濾液抑菌活性。

1.3.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化前后的抑菌活性對(duì)比

采用上述獲得的最佳培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件對(duì)JNC2菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以原始發(fā)酵條件為對(duì)照，測(cè)定其對(duì)柱花草炭疽病菌的抑菌活性，對(duì)比抑菌圈大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 JNC2菌株生長(zhǎng)培養(yǎng)基

JNC2菌株在6號(hào)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最佳，OD600達(dá)到0.717，抑菌圈直徑為26.20 mm (圖1)。在2號(hào)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最差，OD600僅為0.257，抑菌圈直徑為18.90 mm，極顯著低于6號(hào)培養(yǎng)基（P ＜ 0.01）。因此，選用6號(hào)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化。

圖 1 JNC2菌株在6種不同培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況Figure 1 Growth on 6 different media by the JNC2 strain1：1號(hào)培養(yǎng)基；2：2號(hào)培養(yǎng)基；3：3號(hào)培養(yǎng)基；4：4號(hào)培養(yǎng)基；5：5號(hào)培養(yǎng)基；6：6號(hào)培養(yǎng)基。不同小寫(xiě)字母表示同一指標(biāo)不同處理間差異極顯著(P ＜ 0.01)，圖2、圖3、圖4、圖5、圖6、圖7、圖8、圖9和圖10同。1: Medium 1； 2: Medium 2； 3: Medium 3； 4: Medium 4； 5: Medium 5；6: Medium 6. Different lowercase letters indicate significant differences of the same parameter between different treatments at the 0.01 level, similarly for Figure 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10.

2.2 優(yōu)化培養(yǎng)基的確定

以6號(hào)培養(yǎng)基(葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，KH2PO40.2 g，MgSO40.2 g，蒸餾水1 000 mL)為基礎(chǔ)，通過(guò)單因子(碳源、氮源和金屬離子)和正交試驗(yàn)篩選JNC2的優(yōu)選適宜培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。

圖 2 不同碳源對(duì)JNC2菌株發(fā)酵的影響Figure 2 Effects of different carbon sources on the fermentation of JNC2

2.2.1 碳源

不同碳源對(duì)JNC2菌株代謝抑菌活性物質(zhì)和菌體量均有顯著影響(圖2)，單從菌株的菌體量來(lái)看，當(dāng)木糖為碳源時(shí)，OD值最大，為0.537，其次是淀粉，依次是麥芽糖、蔗糖、甘露醇、葡萄糖、果糖、山梨醇，可溶性淀粉的OD值最小，僅為0.246。發(fā)酵濾液活性大小依次為木糖 ＞ 蔗糖 ＞ 可溶性淀粉 ＞ 淀粉 ＞ 葡糖糖 ＞ 果糖 ＞ 麥芽糖 ＞ 甘露醇、乳糖 ＞ 山梨醇。碳源為木糖的發(fā)酵濾液活性及OD600值均達(dá)到最大值，抑菌圈直徑可達(dá)33.30 mm。因此，選用木糖為優(yōu)化培養(yǎng)基的碳源。

2.2.2 氮源

固定碳源為木糖，不同氮源的發(fā)酵濾液活性不同，且10種氮源間差異顯著。當(dāng)?shù)礊槟蛩?、硝酸銨和氯化銨時(shí)，JNC2不能生長(zhǎng)，其OD600和發(fā)酵濾液的抑菌活性均為0，以酵母粉：胰蛋白胨∶氯化銨 = 2∶2∶1作為氮源時(shí)，其JNC2的菌體濃度最高，OD600達(dá)到0.367，發(fā)酵濾液抑菌活性強(qiáng)，其抑菌圈直徑為21.67 mm。因此，選用酵母粉∶胰蛋白胨∶氯化銨 = 2∶2∶1作為優(yōu)化培養(yǎng)基的氮源(圖3)。

2.2.3 無(wú)機(jī)鹽

不同的無(wú)機(jī)鹽對(duì)JNC2菌株的菌體量和發(fā)酵濾液的抑菌活性影響不同，MgSO4能顯著提高JNC2菌株的菌體量和抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生。KH2PO4、MnSO4、NaCl、ZnSO4、FeSO4無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌株生長(zhǎng)量有一定程度的抑制作用，KH2PO4、ZnSO4、FeSO4對(duì)菌株發(fā)酵濾液活性有抑制作用(P ＜ 0.01)。因此，選擇MgSO4作為培養(yǎng)液的無(wú)機(jī)鹽(圖4)。

圖 3 不同氮源對(duì)JNC2菌株發(fā)酵的影響Figure 3 Effects of different nitrogen sources on the fermentation of JNC21，蛋白胨；2，酵母浸出粉；3，麩皮；4，牛肉浸膏；5，蛋白胨:酵母粉 = 1:1；6，酵母粉:胰蛋白胨:氯化銨 = 2:2:1；7，酵母粉:胰蛋白胨:硝酸銨 = 2:2:1；8，尿素；9，氯化銨；10，硝酸銨。1, Peptone； 2, Yeast extract powder； 3, Bran； 4, Beef extract； 5, Peptone:Yeast powder = 1:1； 6, Yeast powder: Peptone: Ammonium chloride =2:2:1； 7, Yeast powder: Peptone: Ammonium nitrate = 2:2:1； 8, Urea； 9,Ammonium chloride； 10, Ammonium nitrate.

2.2.4 正交設(shè)計(jì)

根據(jù)上述碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽的篩選結(jié)果，確定了基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的最適碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽的種類(lèi)，為了優(yōu)化培養(yǎng)基組分配方，利用正交表5因素4水平L16(45)進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定各組分的配比，以JNC2發(fā)酵濾液的抑菌活性為指標(biāo)，以確定適宜JNC2菌株生長(zhǎng)的最佳組合。結(jié)果表明，培養(yǎng)基不同組合配方對(duì)JNC2菌株抑菌活性具有不同的影響，JNC2產(chǎn)抑菌物質(zhì)的最佳發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基組分為木糖2%，蛋白胨0.4%，酵母粉0.8%，氯化銨0.6%，硫酸鎂0.2% (表1)。

圖 4 無(wú)機(jī)鹽對(duì)JNC2菌株發(fā)酵的影響Figure 4 Effects of different inorganic elements on the fermentation of JNC2

2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1 培養(yǎng)溫度的選擇

結(jié)果表明，JNC2菌株在10～40 ℃均能生長(zhǎng)，差異顯著。當(dāng)溫度為26～40 ℃時(shí)菌體生長(zhǎng)量最高，其OD600范圍為0.864～1.085。最適溫度是34 ℃，其OD600為1.085。在發(fā)酵液活性方面，34 ℃時(shí)發(fā)酵液顯示出較強(qiáng)的抑菌活性，其抑制圈直徑可達(dá)20.23 mm，菌體生長(zhǎng)代謝和酶活力受溫度影響，溫度過(guò)高，抑菌活性與菌株產(chǎn)量逐漸下降。因此，發(fā)酵溫度為 34 ℃(圖 5)。

2.3.2 初始pH

JNC2菌株在pH在4.0～9.0時(shí)均可生長(zhǎng)，其中在pH 5.5～9.0時(shí)菌體生長(zhǎng)較佳，當(dāng)pH為6.0時(shí)菌體量最大，OD600值為0.620，說(shuō)明菌株生長(zhǎng)更適于弱酸條件；在抑菌活性方面，pH 6.0時(shí)活性明顯高于pH 7.5～9.0時(shí)的發(fā)酵液活性。當(dāng)pH為6.0時(shí)，JNC2菌株的菌體生長(zhǎng)量和抑菌活性均達(dá)到最大值。因此，選擇最佳初始pH為6.0作為后續(xù)試驗(yàn)(圖6)。

2.3.3 培養(yǎng)轉(zhuǎn)速

在轉(zhuǎn)速為120～200 r·min1時(shí)，隨著轉(zhuǎn)速的升高，JNC2的菌體生長(zhǎng)量和抑菌活性均呈上升的趨勢(shì)，在轉(zhuǎn)速為200 r·min-1時(shí)達(dá)到最大值，JNC2菌株在轉(zhuǎn)速超過(guò)200 r·min-1時(shí)，JNC2菌株的菌體生長(zhǎng)量和抑菌活性呈下降的趨勢(shì)，轉(zhuǎn)速過(guò)高可能引起菌體自溶從而降低發(fā)酵液抑菌活性(圖7)。因此，選用轉(zhuǎn)速為200 r·min-1作為JNC2菌株發(fā)酵轉(zhuǎn)速。

2.3.4 培養(yǎng)時(shí)間

在培養(yǎng)12～72 h時(shí)，JNC2菌株隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，菌體量和發(fā)酵濾液活性逐漸升高，并在72 h時(shí)到達(dá)最大值。在72～120 h，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌體生長(zhǎng)量呈下降趨勢(shì)，發(fā)酵濾液活性維持在一個(gè)穩(wěn)定并且較高的水平上。因此，菌株最佳發(fā)酵時(shí)間為72 h(圖8)。

2.3.5 接種量

JNC2菌株的菌體量和發(fā)酵濾液抑菌活性隨著接種量的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，當(dāng)接種量為7%時(shí)，JNC2菌株菌體量和發(fā)酵濾液的抑菌活性達(dá)到最高峰，此時(shí)抑菌圈直徑為19.90 mm，OD600為0.694 (圖9)。當(dāng)接種量超過(guò)7%時(shí)，菌體量減少，可能是由于接種量過(guò)大，過(guò)度消耗培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分導(dǎo)致的。因此，最佳接種量為7%。

2.3.6 裝液量

當(dāng)裝液量為20～60 mL，JNC2菌株菌體量和發(fā)酵濾液抑菌活性呈上升的趨勢(shì)，當(dāng)裝液量為60 mL時(shí)菌株菌體量和發(fā)酵濾液抑菌活性最高；當(dāng)裝液量超過(guò)60 mL，隨著裝液量的增加，菌株菌體量和抑菌活性逐漸下降(圖10)，表明裝液量過(guò)少或過(guò)多都不利于菌株的發(fā)酵。因此，250 mL三角瓶中裝液量為60 mL是JNC2菌株最佳發(fā)酵裝液量。

2.4 優(yōu)化前后的活性比較

利用最佳培養(yǎng)條件(木糖2%，蛋白胨0.4%，酵母粉0.8%，氯化銨0.6%，硫酸鎂0.2%，初始pH 6.0，250 mL三角瓶裝液60 mL，接種量體積分?jǐn)?shù)7%，34 ℃，200 r·min-1振蕩培養(yǎng) 72 h)培養(yǎng) JNC2 菌株，發(fā)酵濾液的抑菌圈直徑為30.24 mm，比原始條件增加了32.61%。

表 1 培養(yǎng)基的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The orthogonal results of the medium

圖 5 不同發(fā)酵溫度對(duì)JNC2菌株發(fā)酵的影響Figure 5 Effects of different temperatures on the fermentation of the JNC2 strain

圖 6 不同初始pH對(duì)JNC2菌株發(fā)酵的影響Figure 6 Effects of different initial pH on the fermentation of the JNC2 strain

3 討論

圖 7 不同轉(zhuǎn)速對(duì)JNC2菌株發(fā)酵的影響Figure 7 Effects of different rotator speeds on the fermentation of the JNC2 strain

圖 8 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)JNC2發(fā)酵的影響Figure 8 Effects of different incubation times on the fermentation of the JNC2 strain

解淀粉芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens)與枯草芽孢桿菌(B. subtilis)同屬于芽孢桿菌，二者親緣性較高，其活性代謝產(chǎn)物高、種類(lèi)多樣及功能豐富，繁殖能力強(qiáng)、易于工業(yè)化生產(chǎn)、對(duì)人畜無(wú)害、環(huán)境友好等特點(diǎn)，成為近年來(lái)繼枯草芽胞桿菌之后的又一研究和應(yīng)用熱點(diǎn)[6]。生防菌能夠發(fā)揮作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)是抑菌活性代謝產(chǎn)物，其產(chǎn)量的高低直接影響菌株的實(shí)際生防效果，發(fā)酵是獲得大量微生物活性代謝產(chǎn)物的基礎(chǔ)，發(fā)酵過(guò)程不僅僅是復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)，且與微生物細(xì)胞的生命息息相關(guān)，如培養(yǎng)基成分、原料的品質(zhì)、菌種菌量、培養(yǎng)條件等。在微生物的發(fā)酵試驗(yàn)中單因素和正交試驗(yàn)法可以最直接、有效地反映各個(gè)因素對(duì)菌株發(fā)酵的影響[7-9]。有研究表明，優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件可使菌體的生長(zhǎng)速度加快[10-11]、提高抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)量及增加防效。近些年來(lái)，關(guān)于生防菌株發(fā)酵條件優(yōu)化的研究報(bào)道較多[12-13]，其中報(bào)道解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基組分以及發(fā)酵條件優(yōu)化的也不少，盧彩鴿等[14]以番茄灰霉病原菌為靶標(biāo)病原菌，采用單因素試驗(yàn)篩選解淀粉芽胞桿菌MH71菌株的最佳產(chǎn)抗菌物質(zhì)培養(yǎng)基及最佳碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽，用Box-Benhnken試驗(yàn)及響應(yīng)面分析相結(jié)合的方法對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后菌株抑菌能力較優(yōu)化前提高了37.4%。陳敏等[15]以香蕉枯萎病菌4號(hào)生理小種為指示菌，優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌SC1150菌株的液體發(fā)酵條件，優(yōu)化后SC1150菌株對(duì)香蕉枯萎病菌4號(hào)生理小種的抑菌圈直徑由原先23.31 mm提高至28.33 mm。

圖 9 不同接種量對(duì)JNC2發(fā)酵的影響Figure 9 Effects of different inoculum on the fermentation of the JNC2 strain

圖 10 不同裝液量對(duì)JNC2發(fā)酵的影響Figure 10 Effects of different medium volume on the fermentation of the JNC2 strain

由于菌株的來(lái)源不同，菌株本身的生物學(xué)特性存在差異，其發(fā)酵培養(yǎng)條件不能一概而論。楊冬靜等[16]報(bào)道解淀粉芽孢桿菌XZ-1培養(yǎng)基最佳組分為蔗糖5%，糊精10%，氯化鈉7%，蛋白胨10%；XZ-1的最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度27 ℃，培養(yǎng)基初始pH為6.0，培養(yǎng)時(shí)間36 h，接種量3%，轉(zhuǎn)速150 r·min-1，250 mL三角瓶裝液量100 mL。陳哲等[17]研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌CM3培養(yǎng)基最佳組分為豆粕0.5%，玉米粉2%，魚(yú)粉0.5%，NaCl 0.1%；最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)基初始pH為7.0，發(fā)酵時(shí)間48 h，接種量5%，發(fā)酵溫度31 ℃。上述研究結(jié)果表明了不同菌株的最佳發(fā)酵條件不同，每個(gè)菌株都有其獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)需求[18-20]。因此，選擇適應(yīng)菌株自身生長(zhǎng)的培養(yǎng)基組分和最佳發(fā)酵條件，有利于提高菌體產(chǎn)量，使菌株的生防潛力獲得充分的發(fā)揮。

有研究表明，碳氮源、無(wú)機(jī)鹽以及培養(yǎng)基組分之間的配比、培養(yǎng)條件，都會(huì)對(duì)生防菌的抑菌活性有較大影響[21-23]。本研究通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)法對(duì)JNC2菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了菌株發(fā)酵條件為木糖2%，蛋白胨0.4%，酵母粉0.8%，氯化銨0.6%，硫酸鎂0.2%，初始pH 6.0，250 mL三角瓶裝液量為60 mL，接種量體積分?jǐn)?shù)7%，發(fā)酵溫度34 ℃，轉(zhuǎn)速200 r·min-1，發(fā)酵時(shí)間72 h，優(yōu)化后發(fā)酵濾液的抑菌活性顯著提高，為其大面積推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。