體外法研究不同青貯菌、纖維分解酶及碳源組合青貯稻秸對(duì)瘤胃發(fā)酵參數(shù)及產(chǎn)氣量的影響

■歐陽佳良 張 碩 戚如鑫 王夢(mèng)芝

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009）

稻秸中含有豐富的粗纖維類碳水化合物，可作為反芻動(dòng)物重要的飼料來源，但是稻草中粗蛋白含量低、適口性差，直接飼喂反芻動(dòng)物，其采食量和飼料轉(zhuǎn)化率都很低[1]。青貯技術(shù)通過乳酸菌分解秸稈中粗纖維類碳水化合物發(fā)酵生成大量的乳酸以及具有芳香氣味的有機(jī)酸，可以提高飼料的營養(yǎng)價(jià)值和適口性[2]。但稻秸表面富含蠟質(zhì)層和二氧化硅，自然附著乳酸菌少，不易制成優(yōu)質(zhì)的青貯飼料。添加劑能夠提高稻秸的青貯品質(zhì)，而且復(fù)合添加劑的青貯效果優(yōu)于單一添加劑的使用[3]。郭海明等[4]曾報(bào)道同時(shí)添加青貯菌、纖維分解酶和碳源能最好的提升稻秸青貯品質(zhì)。本課題組前期將3 種不同的青貯菌（地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌、糞腸球菌），3種纖維分解酶（黑曲霉、綠色木霉、纖維素酶）和3 種碳源物質(zhì)（葡萄糖、麩皮、淀粉）采用L9(34)正交組合添加至稻秸的青貯中，結(jié)果表明添加劑對(duì)稻秸青貯品質(zhì)和營養(yǎng)成分有很大的影響[5]。但是通過這些添加劑青貯出的稻秸飼料對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵的影響尚不得而知。因此，本試驗(yàn)擬采用人工瘤胃發(fā)酵技術(shù)，將通過不同添加劑組合青貯的稻秸作為發(fā)酵底物，測定其產(chǎn)氣參數(shù)與發(fā)酵參數(shù)。從而探究不同添加劑組合對(duì)青貯稻秸瘤胃發(fā)酵參數(shù)及產(chǎn)氣量的影響，并篩選出最適合于稻秸青貯的添加劑組合。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及瘤胃液的采集

本試驗(yàn)在揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)牧場選取4頭身體健康、體況相近、安裝有永久性瘤胃瘺管山羊，單圈飼養(yǎng)。燕麥草為粗飼料，同時(shí)補(bǔ)飼精料（60%玉米+40%豆粕），每日07：00和19：00等量飼喂，自由飲水。試驗(yàn)當(dāng)天晨飼前，通過瘤胃瘺管，利用自制真空負(fù)壓裝置，從4只瘺管羊的瘤胃中抽取瘤胃液，混勻后經(jīng)4層紗布過濾，濾液裝入事先充滿CO2并39 ℃預(yù)熱的保溫瓶中，帶回實(shí)驗(yàn)室后置于39 ℃水浴鍋中保溫，并持續(xù)通入CO2以待接種。

1.2 試驗(yàn)材料與底物培養(yǎng)

在江蘇省蘇北農(nóng)用稻田內(nèi)收割的水稻秸稈（淮粳5號(hào)），鮮稻秸的含水量為63.55%，以風(fēng)干基礎(chǔ)計(jì)，稻秸中粗蛋白質(zhì)含量為5.86%，中性洗滌纖維含量為71.63%，酸性洗滌纖維含量為40.54%。將秸稈均勻切成3～5 cm，混合均勻后取200 g 鮮樣于30 cm×500 cm真空包裝袋中，將添加青貯菌、纖維素分解酶溶于4 ml超純水中，均勻噴灑在秸稈鮮樣表面，再用真空機(jī)將真空袋抽成真空，于20～22 ℃下貯存。青貯發(fā)酵45 d 后采集樣品，經(jīng)65 ℃烘干制成風(fēng)干樣并粉碎過40目保存，以用作體外試驗(yàn)的發(fā)酵底物。

各組稻秸青貯所用添加劑組合及其發(fā)酵后的營養(yǎng)水平如表1所示。黑曲霉購于鶴壁市百惠生物科技有限公司。綠色木霉、地衣芽孢桿菌、糞腸球菌及植物乳桿菌購于廣州綠輝生物科技有限公司。麩皮、葡萄糖、淀粉購于國藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司。纖維素酶購于湖南鴻鷹祥生物工程股份有限公司。各添加劑的添加量均參照所購產(chǎn)品公司推薦最適宜青貯的添加量。青貯菌中地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌和糞腸球菌的添加量分別為12.0×107、8.0×105CFU/g和6.0×105CFU/g；纖維分解酶中黑曲霉、綠色木霉和纖維素酶的添加量分別為3.0×106、6.0×105CFU/g和60 U/g；碳源中葡萄糖、麩皮和淀粉添加量分別為20、20 mg/g和90 mg/g。

1.3 體外培養(yǎng)與樣品采集

1.3.1 體外發(fā)酵批次培養(yǎng)試驗(yàn)

體外培養(yǎng)參照Cone等[6]的方法，配制人工唾液，將8.75 g碳酸氫鈉(NaHCO3)、1.00 g碳酸氫銨(NH4HCO3)、1.43 g 磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、1.55 g 磷酸二氫鉀（KH2PO4）、0.15 g七水合硫酸鎂（MgSO4·7H2O）、0.52 g硫化鈉（Na2S）、0.015 g 四水合氯化錳（MnCl2·4H2O）、0.002 g六水合氯化鈷（CoCl2·6H2O）、0.012 g六水合氯化鐵（FeCl3·6H2O）、0.017 g 二水合氯化鈣（CaCl2·2H2O）和1.25 mg 刃天青溶解在1 L 蒸餾水中，接種前在39 ℃水浴鍋中預(yù)熱并持續(xù)緩慢通入CO2直至pH值為6.8。將添加不同添加劑組合青貯的稻秸飼料作為發(fā)酵底物，分別稱取500 mg于發(fā)酵瓶中，每組4個(gè)重復(fù)，另外增加4個(gè)空白對(duì)照（不加底物）。將50 ml人工唾液和25 ml 瘤胃液迅速注入發(fā)酵瓶中，并向瓶內(nèi)持續(xù)通入CO2約5 s，立即旋緊瓶塞，在SHA-A型恒溫震蕩水浴鍋中39 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)72 h后將發(fā)酵瓶取出置于冰水浴中，停止發(fā)酵，立即測定培養(yǎng)液pH值，取培養(yǎng)液樣品經(jīng)4 層紗布過濾后分裝于離心管中置于-20 ℃冷凍保存，用于氨氮（NH3-N）濃度、微生物蛋白（MCP）和揮發(fā)性脂肪酸（VFA）的測定。

表1 稻秸添加劑組合及其發(fā)酵后的營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ)，%)

1.3.2 體外發(fā)酵產(chǎn)氣試驗(yàn)

體外發(fā)酵的底物、人工唾液及瘤胃液按照上述準(zhǔn)備并添加至發(fā)酵瓶中，每組設(shè)6 個(gè)重復(fù)，另外增加6 個(gè)空白對(duì)照。持續(xù)通入CO2約5 s 后立即蓋上橡皮塞，將發(fā)酵瓶與64路AGRS-Ⅲ型體外發(fā)酵產(chǎn)氣自動(dòng)記錄裝置的氣路相連接，在39 ℃恒溫下連續(xù)培養(yǎng)72 h。

1.4 體外發(fā)酵指標(biāo)測定

1.4.1 體外發(fā)酵參數(shù)的測定

培養(yǎng)液pH 值采用上海雷磁試驗(yàn)設(shè)備廠pHS-3C型pH計(jì)測定。NH3-N濃度參照馮宗慈等[7]的方法進(jìn)行測定，采用756型可見紫外分光光度計(jì)測定546 nm的吸光度值(OD546nm)。瘤胃微生物蛋白(MCP)濃度采用蘇海崖[8]的方法測定。揮發(fā)性脂肪酸濃度采用Wang等[9]的方法用氣相色譜測定。先將培養(yǎng)液經(jīng)15 000×g 離心10 min 后取上清液1 ml 加0.2 ml 20%含60 mmol/l巴豆酸（內(nèi)標(biāo)物）的偏磷酸，混勻后再次離心取上清液0.4 μl 采用氣相色譜（GC-17A，日本島津公司）測定VFA 濃度。總揮發(fā)性脂肪酸（TVFA）濃度為乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸濃度之和。

1.4.2 產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣參數(shù)的計(jì)算

參照?rskov 等[10]提出的公式模型對(duì)各組的產(chǎn)氣量數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性回歸擬合：

GPt=a+b×(1-e-ct)

式中：GPt——t時(shí)間點(diǎn)的累積產(chǎn)氣量（ml/g DM）；

a——快速產(chǎn)氣部分，即發(fā)酵初始時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣量（ml/g DM）；

b——緩慢產(chǎn)氣部分，即理論最大產(chǎn)氣量(ml/g DM);

c——體外發(fā)酵產(chǎn)氣速率常數(shù)（ml/h）；

a+b——潛在產(chǎn)氣量（ml/g DM）。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2016對(duì)試驗(yàn)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用SPSS16.0 進(jìn)行單因素方差分析和Duncan's 進(jìn)行多重比較。P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同添加劑組合對(duì)青貯稻秸體外發(fā)酵pH 值、NH3-N和MCP濃度的影響

表2 中，除9 組以外，各組pH 值一直維持在6.0～7.0之間，且各組之間沒有顯著性差異（P＞0.05）。5、9組中NH3-N濃度顯著高于其他組，而1組NH3-N濃度顯著低于其他組（P＜0.05）。對(duì)照組MCP 濃度顯著低于其他各組，而3組和8組MCP濃度最高（P＜0.05）。

表2 體外模擬瘤胃發(fā)酵pH值、NH3-N濃度和MCP含量

2.2 不同添加劑組合對(duì)青貯稻秸體外發(fā)酵揮發(fā)性脂肪酸（VFA）濃度的影響

由表3 可知，對(duì)照組和1 組TVFA、乙酸、丁酸、異戊酸和戊酸的含量都顯著低于其他組（P＜0.05），且對(duì)照組和1 組的丙酸和異丁酸含量也很低，但1 組的TVFA、乙酸、丙酸、丁酸、和戊酸都顯著高于對(duì)照組。3組的TVFA、丙酸和丁酸顯著高于其他組，除4和9組外，3組的乙酸濃度也顯著高于其他組（P＜0.05）。9組乙丙比顯著高于其他組，而1組乙丙比顯著低于其他組（P＜0.05）。

表3 體外模擬瘤胃發(fā)酵VFA濃度測定

2.3 不同添加劑組合對(duì)青貯稻秸體外發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響

由表4 可知，對(duì)照組發(fā)酵累積產(chǎn)氣量、理論最大產(chǎn)氣量、潛在產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣速率常數(shù)都顯著低于其他組（P＜0.05），而3組累積產(chǎn)氣量、理論最大產(chǎn)氣量和潛在產(chǎn)氣量都顯著高于其他各組（P＜0.05）。9組產(chǎn)氣速率常數(shù)最高，且除3組外，9組累積產(chǎn)氣量顯著高于其他組（P＜0.05）。

表4 不同添加劑對(duì)青貯稻秸體外產(chǎn)氣量的影響

3 討論

3.1 不同添加劑組合對(duì)青貯稻秸體外發(fā)酵pH 值、NH3-N和MCP濃度的影響

瘤胃pH值是瘤胃內(nèi)環(huán)境的重要指標(biāo)，最適合瘤胃微生物生長繁殖的pH值范圍為6.0～7.0[11]。本試驗(yàn)中，各組pH值之間沒有顯著性的差異，說明不同添加劑組合對(duì)青貯稻秸體外發(fā)酵pH值沒有影響。NH3-N能夠?yàn)槲⑸锾峁?8%～100%的氮源，是瘤胃微生物生長所需要的主要氮源[12]。NH3-N還能在一定程度上反映出瘤胃微生物對(duì)飼料中含氮物質(zhì)的分解與利用情況，其在瘤胃內(nèi)的濃度不宜過高或過低，有研究表明，瘤胃微生物生長的最適NH3-N濃度為5～28 mg/100 ml[13-14]。本試驗(yàn)中，所有組別的NH3-N 濃度都在適宜的范圍內(nèi)，但5、9組NH3-N濃度顯著高于其他組，可能是因?yàn)?、9組底物中蛋白含量較高，促進(jìn)了瘤胃微生物對(duì)飼料中含氮物質(zhì)的降解。MCP是反芻動(dòng)物最主要的蛋白質(zhì)供應(yīng)者，能提供反芻動(dòng)物蛋白質(zhì)需要的40%～80%[15]。飼糧的類型、瘤胃微生物的數(shù)量以及瘤胃內(nèi)氮源和能量的有效同步都會(huì)影響瘤胃內(nèi)MCP 的濃度[16]。本研究中，對(duì)照組MCP濃度顯著低于其他各組，而3組和8組MCP濃度最高。說明添加劑能夠提高青貯稻秸體外發(fā)酵MCP濃度，并且以3組和8組的效應(yīng)最佳。

3.2 不同添加劑組合對(duì)青貯稻秸體外發(fā)酵VFA濃度的影響

反芻動(dòng)物瘤胃微生物通過降解飼糧中的碳水化合物繼而發(fā)酵產(chǎn)生VFA，作為反芻動(dòng)物主要的能量來源[15]。VFA 的比例和濃度與飼糧中纖維類物質(zhì)含量有很大聯(lián)系，瘤胃液中的TVFA 隨飼糧中的纖維含量提高而降低[17]。還有研究報(bào)道，瘤胃液中乙酸的濃度與飼糧中NDF 含量呈高度的正相關(guān)[18-19]。本試驗(yàn)中，對(duì)照組TVFA 的濃度最低，說明青貯添加劑能夠降低稻秸中粗纖維的含量，從而提高TVFA 濃度。處理中1、2、7、8組的TVFA也較低，說明1、2、7、8組的青貯稻秸纖維含量較高，青貯品質(zhì)較差。然而，3 組的TVFA、乙酸、丙酸和丁酸含量都很高，說明3組添加劑組合的方式能夠最好的提升稻秸的青貯品質(zhì)。除3 組外，9 組中乙酸濃度及乙丙比都較高可能是因?yàn)? 組青貯稻秸中NDF 含量較高，而NDF 在維持瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)及其功能方面發(fā)揮著重要作用[20]。

3.3 不同添加劑組合對(duì)青貯稻秸體外發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響

飼料的體外發(fā)酵產(chǎn)氣量可以反映飼料在瘤胃中的可發(fā)酵程度，瘤胃微生物的數(shù)量，降解能力以及發(fā)酵底物的自身特性共同決定飼料體外發(fā)酵的產(chǎn)氣量[21]。體外發(fā)酵的累積產(chǎn)氣量與發(fā)酵底物飼料中的NDF含量呈負(fù)相關(guān)，而與飼料中的CP含量呈正相關(guān)[22]。青貯飼料在發(fā)酵過程中，乳酸菌不僅可以利用飼料中可溶性碳水化合物發(fā)酵生成乳酸，還可以消化飼料中的含氮物質(zhì)發(fā)酵生成菌體蛋白，提高青貯飼料中的CP含量[23]。纖維分解酶可以分泌降解纖維素、木質(zhì)素的酶類降解青貯飼料中的NDF、ADF類碳水化合物，從而為乳酸菌提供發(fā)酵底物[24]。所以，青貯飼料的品質(zhì)直接影響青貯飼料的體外發(fā)酵產(chǎn)氣量。本試驗(yàn)中，處理組的發(fā)酵累積產(chǎn)氣量、理論最大產(chǎn)氣量、潛在產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣速率常數(shù)都顯著高于對(duì)照組，再次說明青貯添加劑能夠提高稻秸的青貯品質(zhì)。且3組累積產(chǎn)氣量、理論最大產(chǎn)氣量和潛在產(chǎn)氣量都顯著高于其他各組，說明3組的添加劑組合能夠最好的提高稻秸的青貯品質(zhì)及其營養(yǎng)價(jià)值。

4 結(jié)論

綜合體外發(fā)酵參數(shù)和產(chǎn)氣量的結(jié)果表明，青貯添加劑能夠通過提高稻秸的青貯品質(zhì)及其營養(yǎng)水平從而提高青貯稻秸體外發(fā)酵性能，其中3組(即地衣芽孢桿菌+纖維素酶+淀粉)效果最好。