柴胡皂苷d與阿奇霉素對人型支原體活性的對比研究

賈亞利 劉玨 吳黎明 蔡鶯蓮 吳盛海

從人體分離出來的支原體有16種，常見與泌尿生殖道感染有關的有解脲支原體（Uu）、人型支原體（Mh）、生殖支原體（Mg）等［1］，其中人型支原體是最常見的致病菌之一，其可以引起非淋球菌性尿道炎、宮頸炎，進而引發前列腺炎、腎盂腎炎、女性盆腔炎等，并可能與不孕不育、習慣性流產、胎兒宮內發育遲緩等有關［2-4］。有報道稱，在男性支原體感染可以影響精子的濃度、活動度、形態，且可能破壞生精細胞，從而導致男性不育［5］。臨床治療常選用抗生素治療，阿奇霉素是指南推薦的一線用藥，但耐藥率越來越普遍，治療變成一個棘手的問題，尋找一種有針對性的藥物成為治療的方向［6］。本實驗比較柴胡皂苷d（Sd）與阿奇霉素對人型支原體在體外的抗菌活性。

1 材料與方法

1.1 材料 培養基購自珠海迪爾生物工程有限公司。受試菌株人型支原體來自杭州市第一人民醫院皮膚科及婦產科的臨床分離株。阿奇霉素針劑，購自東北制藥企業沈陽第一制藥有限公司。柴胡皂苷d購自中國藥品生物制品研究所。水溶性柴胡皂苷單體d溶于滅菌的雙蒸水，與阿奇霉素針劑均配置成濃度為1280mg/L的備用液，置于-20°冰箱備用，臨用前解凍。

1.2 菌株的準備 支原體菌懸液制備和接種20株Mh受試菌株自臨床分離傳代后，接種至支原體液體培養基，37℃恒溫箱中 48h，至生長最佳狀態（CFU＞104）［7］，取100μl接種于預熱的藥物敏感測試板。

1.3 實驗方法 棋盤微量稀釋法，其能精確測定抗菌藥物在不同濃度時對微生物生長的抑制作用。具體方法：阿奇霉素和柴胡皂苷的起始濃度均為256mg/L，并在滅菌管中進行10級倍比稀釋。在96孔（12×8）板的前2排中依次加入倍比稀釋好的不同濃度的阿奇霉素100μl，在第3和第4排中加入不同濃度的柴胡皂苷d各100μl，在所有測試的40個孔中均加入100μl待測菌液，縱向第11列加200μl待測菌液，不加藥物作為生長對照，第12列加入200μl液體支原體培養基，作為空白對照。

1.4 Sd及阿奇霉素對Mh作用的結果判定，接種后的96孔板置于37℃恒溫箱中培養48h，采用視覺終點判定。藥物敏感終點判讀參考M-27中對微量液體培養基稀釋法的標準，抗生素類藥物以80%抑菌作為觀察終點，判斷最低抑菌濃度（MIC）。柴胡單體的結果判斷參考抗生素類藥物進行。

2 結果

Sd對Mh的MIC值在0.25～8mg/L，阿奇霉素對Mh的MIC值在0.25～64mg/L；采用配對t檢驗，計算出 t=2.3368，查表知 t0.05（19）=2.093，t0.01（20）=2.861，t0.05（19）＜t＜t0.01（20），兩組差異有統計學意義（P＜0.05）。Sd 的MIC50為1mg/L，阿奇霉素MIC50為2mg/L。Sd與阿奇霉素在體外對人型支原體均有抑菌作用。Sd對Mh的抑菌作用優于阿奇霉素。見表1、2。

表1 Sd及阿奇霉素對20株人型支原體的MIC（mg/L）

表2 Sd與阿奇霉素對Mh的MIC比例［n（%）］

3 討論

阿奇霉素屬于大環內酯類抗生素，其作為指南推薦的抗支原體一線治療藥物，在臨床使用中，胃腸道的副作用發生率較高，多數患者出現惡心、食欲不振等腸胃不適，嚴重者嘔吐。且在近幾年研究中發現，其耐藥率比例也較高，導致臨床治療失敗病例逐漸增多，感染病情遷延不愈［1］。阿奇霉素的抗菌作用，通過與細菌核糖體50s亞基結合，阻礙細菌轉肽過程，抑制依賴于RNA的蛋白質合成從而達到抗菌作用。支原體對其耐藥產生機制主要是生物膜的形成［8］，生物膜增強Mh對大環內酯類、四環素等多種常用抗生素的抵抗力。

黃崢燁等［9］研究認為柴胡皂苷d對解脲支原體有抑菌作用，發現50株解脲支原體對四環素、紅霉素、環丙沙星均有不同程度的耐藥，但同時卻對Sd顯示敏感，即在體外實驗中，Sd的抗菌活性優于這三種抗生素。本實驗中Sd也顯示較強的對于人型支原體的抗菌活性。陳志寶等研究柴胡皂苷a對金黃色葡萄球菌的抑菌作用［10］，采用基因芯片檢測，結果表明，柴胡皂苷a作用于金黃色葡萄球菌45min后引起相關基因表達水平的改變在所有監測基因中，26個上調基因，68個下調基因，其中有13個毒力因子的表達受到影響，且表達水平全部下調，即抑制金黃色葡萄菌的毒力水平；1個編碼超氧負離子壓力反應蛋白基因vraR和vraS被誘導上調；還有4個核黃素合成蛋白ribA，B，H，D被顯著抑制，這幾個是酶的輔助因子的合成基因，在呼吸代謝途徑起作用，同時還與超氧負離子有關。也可以認為柴胡皂苷d的作用機制，可能在基因水平上降低多糖及某些蛋白質的合成從而抑制生物膜的形成。這些均需要進一步的科學實驗證實。

新藥的臨床前藥理研究是過渡到臨床的重要橋梁，也是評價新藥的關鍵步驟。一個新的化合物或分離提取有效成分是否有抗菌作用，需要藥理實驗證實。首先采用體外試驗方法，觀察試驗物對病原菌有無殺滅作用或抑制作用。篩選到體外實驗有效的化合物應進一步確定其分子結構，為深入研究提供數據。作者觀察到的柴胡皂苷單體d在體外實驗中，對人型支原體Mh有較好的抑制作用，效果顯著強于阿奇霉素，值得對其進行進一步深入研究，也應該測試其對于常見的球菌、桿菌等致病微生物的體外抗菌實驗研究，為最終進行動物體內藥理研究打下基礎。