基于脂質組學探索狼瘡定調節MRL/lpr狼瘡鼠肝臟脂代謝紊亂的作用

盧璐 趙燕霞 胡長鋒 李海昌 謝冠群*

系統性紅斑狼瘡（SLE）是一種累及泌尿、血液、心血管等系統以及全身多個器官的自身免疫性疾病［1-2］。血脂異常引起的動脈粥樣硬化（AS）及相應心血管事件是當前導致SLE患者死亡的主要原因之一［3-4］。SLE患者肝臟脂質代謝異常，致使存在特有的“狼瘡型”血脂異常［5］；并且血脂異常與自身性抗體、炎癥因子的分泌具有顯著的相關性［6］。同時，SLE最常用的治療藥物糖皮質激素（GCs）會加劇糖脂代謝的紊亂。狼瘡定是在長期臨床實踐中提出解毒祛瘀滋陰法治療SLE的基礎上形成的經驗方，在臨床和動物研究中均證實具有控制疾病活動性以及減輕GCs導致的糖脂代謝紊亂等副作用的功效［7-8］。2017年8月至9月作者應用多維質譜“鳥槍”法脂質組學（MDMS-SL）技術對MRL/lpr狼瘡鼠肝臟組織中脂質分子進行全面地定性定量分析，探討狼瘡定的調節機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 （1）狼瘡定：青蒿12g、干地黃15g、炙鱉甲12g、升麻9g、白花蛇舌草15g、赤芍12g、積雪草15g、炒薏苡仁15g、佛手片9g、生甘草6g。（2）藥物與試劑：強的松（浙江仙居制藥）。脂質標準品購自Avanti和Nu-Chek公司。化學試劑甲醇和氯仿均為色譜純，其余為試劑純。BCA試劑盒來自美國Thermo Scientific公司。（3）實驗動物：上海實驗動物中心提供的6周齡MRL/lpr雌性小鼠，C57BL/6雌性為正常對照，均為SPF級，自由攝食、水飲，飼養環境完全相同。所有實驗操作均按照國家相關的實驗動物飼養和使用條例，遵照浙江中醫藥大學動物倫理學條例。

1.2 儀器與設備 美國Thermo Fisher Quantiva質譜儀；美國Advion 納噴離子源；杭州奧盛儀器有限公司WD-12氮吹儀；美國Thermo Fisher多功能酶標儀。

1.3 實驗方法（1）實驗小鼠分組：所有小鼠適應性喂養2周后，MRL/lpr小鼠隨機分為4組，分別為模型組、激素組、狼瘡定組和中西醫結合組，6只/組。C57BL/6為正常對照組。激素組：強的松10mg/kg給藥；狼瘡定組：狼瘡定3.15g/kg；中西結合組：狼瘡定和激素均按原劑量等量混合配制成混懸液，每只小鼠均灌胃0.3ml；正常對照組灌胃0.3ml高純水。各組均連續干預10d。（2）肝臟組織采集：10d后，將每組小鼠處死采集肝臟組織，每只小鼠收集同一位置的肝臟部位，切開后用PBS溶液沖洗干凈，分裝，用球磨儀將各肝臟組織研成粉末，每個稱取25mg左右分別溶于1000ml PBS溶液中，超聲進一步粉碎處理，置于-80℃，備用。（3）肝臟脂質提取物的制備：按照文獻，該實驗采用氯仿/甲醇溶劑體系對各肝臟中的脂質進行提取［10］。（4）MDMS-SL分析：根據前期已經建立的方法分析提取物中各類脂質［9-11］。

1.4 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。計量資料以（）表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠肝臟中酰基肉堿類和4-羥基壬烯醛（HNEs）脂質的變化 本實驗共檢測13種酰基肉堿類脂質。結果表明，與正常對照組比，模型組小鼠肝臟中各類酰基肉堿類脂質均顯著升高，總量從正常組的（8.71±1.36）pmol/mg提高至模型組的（13.4±0.73）pmol/mg蛋白（P＜0.05）。對各組小鼠肝臟組織HNEs進行定性定量分析。與正常組相比，模型組小鼠肝臟中HNEs的含量明顯升高。見圖1。

圖1 各組小鼠肝臟組織中酰基肉堿類脂質和4-羥基壬烯醛類總含量

2.2 各組小鼠肝臟中TAGs含量的變化 利用MDMSSL方法對各組小鼠肝臟中36種TAGs分子進行定性定量分析。結果表明，與正常組比，模型組、激素組和中西醫結合組小鼠肝臟中TAGs總含量出現不同程度下降。模型組小鼠肝臟TAGs總含量降低，可能與SLE肝臟對乳糜微粒中TAGs吸收和降解能力減弱有關，導致血液系統中TAGs無法被及時利用，造成一定程度的積累。經單純狼瘡定干預后，肝臟內TAGs含量可以恢復到接近正常水平，該結果表明狼瘡定對SLE肝臟TAGs代謝紊亂具有較好的調節作用。見圖2。

2.3 各組小鼠肝臟中各類磷脂及溶血磷脂的變化MDMS-SL分析結果表明，與正常組相比，模型組和各治療組小鼠肝臟組織中各類磷脂的總含量未發生顯著性變化（見表1）。根據MDMS-SL結果顯示，模型組中不同類型的溶血性磷脂酰膽堿的含量變化趨勢不同（見圖3），表明模型組中磷脂酶PLA2的活性增強，水解生成大量不飽和脂肪酸用于合成生物活性物質，參與免疫炎癥反應。經不同手段干預后，不同類型溶血性磷脂具有向正常水平回歸的趨勢，但差異無統計學意義，可能與該實驗用藥干預時間較短有關。

圖2 各組鼠肝臟中TAGs分子的總含量

圖3 正常小鼠和MRL/lpr 鼠肝臟中各種溶血性磷脂膽堿的含量

表1 各組小鼠肝臟中各類磷脂和鞘脂總含量（）

表1 各組小鼠肝臟中各類磷脂和鞘脂總含量（）

注：磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺濃度單位為nmol/mg 蛋白，其余均為pmol/mg 蛋白

脂質種類 正常組 模型組 激素組 中西醫結合組 狼瘡定組磷脂酰膽堿 48.38±3.77 51.93±1.76 54.08±2.58 51.52±3.16 49.58±3.05磷脂酰乙醇胺 30.58±2.45 31.83±1.88 33.44±2.08 31.98±1.95 32.15±3.00磷脂酰甘油 996.08±28.79 1036.57±71.22 1028.25±79.91 1061.79±47.48 974.51±22.76磷脂酰肌醇 6926.97±668.24 5818.25±176.24 6331.4±299.57 5805.61±254.65 624.04±340.14鞘磷脂 2393.87±391.14 2364.38±66.72 2166.27±340.61 2666.24±247.25 2467.98±419.59

3 討論

酰基肉堿類脂質是肉堿與不同脂肪酸形成的一類脂質，是脂肪酸穿過質膜進入線粒體發生β-氧化的重要中間體，因此其含量可以反應細胞能量代謝的水平及線粒體功能。本資料結果表明MRL/lpr小鼠肝臟存在一定的線粒體功能障礙，導致酰基肉堿類無法被利用，在組織中大量積累。與模型組相比，經不同手段干預后，各治療組小鼠肝臟中的各類酰基肉堿類脂質均出現不同程度的下降，回調至正常水平。表明經治療后，MRL/lpr鼠肝臟中線粒體功能得到了一定程度的恢復。

線粒體在脂肪酸β-氧化過程中會產生大量自由基，在線粒體功能存在障礙時，這些自由基會大量外逸，導致氧化應激水平升高［12］。HNEs是脂質過氧化的終產物，在正常生理濃度時，對各組織正常功能的發揮具有重要的意義。然而，在氧化應激狀態下，此類化合物會破壞各種酶、跨膜蛋白及DNA的正常功能［11］。各類磷脂是生物體系中質膜和血液系統中各種脂蛋白的重要組成部分。另外，位于sn-2位上的不飽和脂肪酸在相應酶的作用下水解生成游離脂肪酸用于生成前列腺素、血栓烷素等生物活性物質。溶血性磷脂是僅含有一條脂肪酸鏈的磷脂類脂質分子，具有破壞細胞完整性的能力［11］。

狼瘡定是由升麻鱉甲湯加減化裁而來，由干地黃、升麻、炙鱉甲、青蒿、白花蛇舌草、佛手、積雪草、炒薏苡仁、赤芍和生甘草組成，方中干地黃、赤芍可以清熱涼血滋陰，升麻、白花蛇舌草清熱解毒清斑，青蒿退熱除蒸，佛手疏肝解郁，炒薏苡仁健脾祛濕，鱉甲“甘潤咸寒，可安邪氣經擾之陰，活血化瘀”，甘草解毒的護中，諸藥合用，共奏解毒、祛瘀、滋陰之效。狼瘡定主要針對SLE熱毒血瘀陰虛的病機，再加上激素的耗傷真陰，加劇陰虛血瘀等證候。從現代藥理學角度而言，方中多味中藥含有大量具有抗氧化作用的活性成分物質，也驗證經狼瘡定治療后，小鼠肝臟中脂質過氧化終產物的含量顯著下降。因此，脂質組學也在一定程度上揭示狼瘡定調節肝臟脂質代謝紊亂的作用機制，為狼瘡定的進一步臨床推廣提供理論基礎。

本研究利用MDMS-SL方法對各組小鼠肝臟組織中各類脂質進行定性定量分析。結果表明，經狼瘡定或者聯合GCs干預后，MRL/lpr狼瘡鼠肝臟組織中酰基肉堿類脂質、HNEs、TAGs和溶血磷脂類脂質具有顯著回歸正常的趨勢，表明狼瘡定具有調節肝臟脂代謝紊亂的功能，其作用的機制可能與恢復線粒體功能，降低氧化應激水平及減少免疫炎癥的發生密切相關。