冬凌草毛狀根體系的建立

張利軍 宋小鋒 朱畇昊

[摘 要]用發(fā)根農桿菌（Agrobacterium rhizogenes）ATCC15834、ACCC10060、C58C1菌株對冬凌草無菌幼苗的葉片、莖段進行侵染，而后通過共培養(yǎng)的方法誘導其產生冬凌草毛狀根，從而建立有效的冬凌草毛狀根培養(yǎng)體系。通過PCR進一步檢測T-DNA是否成功導入冬凌草毛狀根中。通過用發(fā)根農桿菌ATCC15834、ACCC10060、C58C1菌株對冬凌草外植體進行侵染，能夠成功誘導產生冬凌草毛狀根，從而對冬凌草毛狀根培養(yǎng)體系進行建立，在一定程度上為冬凌草毛狀根的大規(guī)模培養(yǎng)奠定基礎。

[關鍵詞]冬凌草;毛狀根;發(fā)根農桿菌;PCR

[中圖分類號]S567.71 [文獻標識碼]A

冬凌草（Rabdosia rubescens）在清熱解毒、健胃活血、消炎止痛及抗腫瘤方面具有很好的功效。冬凌草次生代謝產物主要包括有萜類、甾體類、揮發(fā)油及黃酮類化合物。其在抗腫瘤方面具有很好的作用，而且在進行的相關毒性實驗測定中發(fā)現其并沒有明顯的毒性，這就使得其所具有的潛在藥用價值被國內外眾多學者所關注。

毛狀根培養(yǎng)因具有使得植物快速生長、對外源植物激素沒有依賴性等特點被眾多學者所青睞。利用植物組織培養(yǎng)的方法進行次生代謝產物的生產不僅可以在一定程度上人為地對生產進度進行控制，使得生產過程不受環(huán)境的制約，而且能夠在一定程度上對目的次生代謝產物的產量進行大規(guī)模的提高。因此，通過實驗對冬凌草毛狀根體系進行建立從而在一定程度上提高冬凌草次生代謝產物的生物合成量，這對于冬凌草藥用價值的研究具有著非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

冬凌草植株采集自濟源冬凌草種植基地，發(fā)根農桿菌C58C1、ACCC10060、ATCC15834菌株均由實驗室保存。

1.2 試劑與儀器

新型植物基因組DNA提取試劑盒，DNA Marker， Taq Mix（康為世紀），頭孢噻肟鈉（歐意藥業(yè)），分光光度計（上海翱藝），電泳儀（BIO-RAD），分析天平（上海申安）。

2 實驗方法

2.1 發(fā)根農桿菌菌株的活化與培養(yǎng)

分別取200μL于-80℃條件下保存的菌株ATCC15834、C58C1、ACCC10060，將其加入到已配制好的20mlYEB 液體培養(yǎng)基中，隨后在27℃黑暗條件下對其進行200 rpm的快速振蕩培養(yǎng)，待培養(yǎng)一段時間后對菌液OD600值進行測定，當其數值在0.3左右時以等體積的量向培養(yǎng)基中加入100μmol·L-1的乙酰基丁香酮（AS），隨后對培養(yǎng)基進行繼續(xù)振蕩，待菌液的OD600值培養(yǎng)至0.6左右時，停止振蕩培養(yǎng)。在27℃條件下以4000 rpm的轉速對菌液進行10 min的離心，離心過后將上清液倒掉保留沉淀，隨即以同等體積的量加入MS液體培養(yǎng)基和100μmol·L-1的AS混合液對菌體進行懸浮培養(yǎng)，繼續(xù)活化30min后轉化。

2.2 冬凌草毛狀根的誘導與除菌

將培育良好的幼嫩冬凌草無菌苗葉片于無菌操作臺上進行均勻的剪切，隨后將其分別接種于不含有激素的MS固體培養(yǎng)基中，進行3-5天的預培養(yǎng)。待預培養(yǎng)結束，于無菌操作臺上取出幼嫩的外植體葉片，并用無菌針在其葉片上進行扎口，隨后將扎口后的葉片放入到已經活化好的上述菌液中，侵染15min，侵染過后將葉片從菌液中取出并通過無菌濾紙將葉片上剩余的菌液進行吸干，然后將其接種在含有100 μmol·L-1AS的MS固體培養(yǎng)基中，并于25.0℃培養(yǎng)條件下進行4d的共培養(yǎng)。

待共培養(yǎng)結束后，取出外植體并用無菌濾紙將其附帶水分進行吸干，隨后將外植體接種到含有500mg·L-1的頭孢噻肟鈉的除菌MS固體培養(yǎng)基上，并將其置于25℃的環(huán)境中進行暗培養(yǎng)，以促使其能夠發(fā)根。培養(yǎng)過程中，每隔10d將其轉入到新鮮的含有500mg·L-1的頭孢噻肟鈉同種培養(yǎng)基中，直到外植體長出毛狀根。

在培養(yǎng)過程中，當毛狀根的長度達到1-2cm左右時，將毛狀根用無菌剪刀剪下并將其接種到含有500mg·L-1的頭孢噻肟鈉的1/2 MS除菌固體培養(yǎng)基上。每隔7d 繼代培養(yǎng)一次，如此重復3-4次，其間并不斷降低除菌培養(yǎng)基中頭孢噻肟鈉（Cef）的含量，直至最后Cef的含量為零。

2.3 冬凌草毛狀根誘導的條件優(yōu)化

2.3.1 菌株類型：實驗所用到的菌株分別為發(fā)根農桿菌C58C1、ATCC15834、ACCC10060菌株。

2.3.2 預培養(yǎng)時間：預培養(yǎng)時間為2d、3d、4d。

2.4 冬凌草毛狀根的PCR檢測

冬凌草毛狀根及葉片的roLB和roLC基因的PCR檢測。冬凌草毛狀根DNA提取按照DNA提取試劑盒操作。通過建立20μL的PCR反應體系對冬凌草毛狀根及葉片的roLB和roLC基因進行擴增檢測。待擴增反應完成后，用1.0 %的瓊脂糖凝膠電泳對其進行檢測，待電泳完成后進行觀察。

3 結果與分析

3.1 毛狀根的誘導

誘導用發(fā)根農桿菌ACCC10060、ATCC15834、C58C1對預處理的冬凌草葉片進行侵染能夠使得冬凌草葉片被成功誘導產生冬凌草毛狀根。對其進行大約10d的共培養(yǎng)，被侵染的冬凌草葉片與莖尖處開始產生黃白色的顆粒狀突起，而后突起的部位開始進行發(fā)根，在此條件下產生的根具有明顯的向上或斜向上生長的特性，沒有出現向地性，出現較多呈白色的根毛。

繼續(xù)培養(yǎng)兩周左右，冬凌草毛狀根長大并產生許多側根。將其轉接至除菌培養(yǎng)基3-4次進行徹底的除菌，待除菌徹底后挑選出生長旺盛、分支多的冬凌草毛狀根，隨后將此毛狀根接種在不含有外源激素的1/2 MS固體培養(yǎng)基中，待培養(yǎng)一段時間后毛狀根表現出較為良好的生長狀況。

3.2 冬凌草毛狀根誘導的條件優(yōu)化

3.2.1 發(fā)根農桿菌菌株對冬凌草毛狀根誘導的影響

根據實驗結果進行統(tǒng)計，發(fā)根農桿菌不同菌株類型對冬凌草毛狀根的誘導如表1所示：

3.2.2 預培養(yǎng)時間對冬凌草毛狀根誘導的影響

實驗過程中分別將2d、3d、4d設置為發(fā)根農桿菌C58C1對冬凌草葉片的預培養(yǎng)時間。其對冬凌草毛狀根誘導結果如表2所示：

3.3 冬凌草毛狀根的PCR檢測結果

圖示中所標注的7和8分別代表ATCC 15834菌株所誘導的冬凌草毛狀根的rolB和rolC基因擴增出的特異性片段，條帶9和10則分別代表ACCC 10060菌株誘導的冬凌草毛狀根的rolB和rolC基因擴增出的特異性片段，而條帶11和12表示C58C1菌株誘導的冬凌草毛狀根的rolB和rolC基因擴增出的特異性片段，條帶大小均與目的基因大小一致;圖中標注13和14的位置對應為陰性對照的冬凌草幼嫩無菌苗的rolB、rolC基因擴增出的特異性片段，實驗過程中并未出現條帶。

M：核酸分子量標準DL2000;1-6：作為陽性對照的ATCC15834、ACCC10060、C58C1菌株質粒DNA的PCR擴增結果;7-12：不同菌株誘導的毛狀根單克隆的DNA的PCR擴增結果;13-14：作為陰性對照的冬凌草無菌苗的DNA的PCR擴增結果。

4 結論與討論

不同的菌株對同一植物進行侵染時，其對發(fā)根的誘導率可能產生不同的結果。在本實驗中，共選取三種不同的發(fā)根農桿菌（ACCC10060、ATCC15834、C58C1）對冬凌草進行侵染誘導，結果表明，在其他外部條件均相同的時候發(fā)根農桿菌C58C1的誘導率是最佳。預培養(yǎng)的時間對于發(fā)根農桿菌侵染誘導冬凌草具有影響作用。本實驗發(fā)現冬凌草最佳的預培養(yǎng)時間是3d，該條件下不僅能夠使得冬凌草的發(fā)根誘導率高達68.8%，而且冬凌草的出根時間是較為早的、出根數量相對較多、生長狀況方面也相對良好。我們認為很大的原因可能是由于適當的預處理時間能夠在一定程度上降低發(fā)根農桿菌在侵染冬凌草的過程中對其造成的脅迫傷害，并且能夠在一定程度上使得要轉化的外植體細胞維持在適宜發(fā)根農桿菌侵染的生理狀態(tài)即感受狀態(tài)。本實驗所建立的有效的冬凌草毛狀根培養(yǎng)體系、冬凌草毛狀根的大規(guī)模培養(yǎng)體系，為使用對毛狀根生產冬凌草次生代謝產物的奠定了堅實的基礎。

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