基于文獻的氣滯血瘀證差異表達譜生物信息學研究＊

何浩強，陳 光，高嘉良，胡 坤，劉 超，王 階＊＊

（1.中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院心血管科 北京 100053；2.北京中醫(yī)藥大學研究生院 北京 100029）

證候的生物學基礎(chǔ)研究是中醫(yī)客觀化研究的關(guān)鍵部分，幾十年來，學者從整體、細胞、分子等多個層面做了相關(guān)探索。隨著后基因組時代的到來，證候生物學基礎(chǔ)研究在基因?qū)用嬲业叫碌姆较颉＝栌没蛐酒⒒驕y序等技術(shù)，篩查與證候相關(guān)的基因差異表達譜，并通過已有的基因注釋信息，對差異表達譜進行生物信息學分析以探索與證候發(fā)生相關(guān)的生物功能或信號通路，從而為揭示證候的發(fā)生機制提供理論支持[1]。氣滯血瘀證是中醫(yī)臨床常見證候之一，現(xiàn)有研究已發(fā)現(xiàn)其與微循環(huán)障礙、血液流變學改變、炎癥、凝血-纖溶系統(tǒng)失衡、內(nèi)皮功能障礙、免疫功能紊亂等病理改變相關(guān)，另外，氣滯血瘀證研究在組學層面也取得一定進展，但尚未完全闡明氣滯血瘀證發(fā)生機制，同時，對于不同研究得到的差異結(jié)果，未建立起氣滯血瘀證基因數(shù)據(jù)庫。因此，本文通過查找氣滯血瘀證組學研究相關(guān)文獻，梳理歸納現(xiàn)有研究結(jié)果，并運用生物信息學方法對基因差異表達譜進行綜合分析，以期為氣滯血瘀證組學研究提供新的思路。

1 材料

1.1 文獻檢索

在中國知網(wǎng)——《中國學術(shù)期刊（網(wǎng)絡(luò)版）》和PubMed 數(shù)據(jù)庫中以“氣滯血瘀證、氣滯血瘀、血瘀氣滯、基因、DNA、RNA、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA”以及相應英文為檢索詞，檢索時間限定為建庫至2018年2 月，檢索氣滯血瘀證組學層面研究的相關(guān)文獻。將檢索得到的文獻根據(jù)以下納入/排除標準進行篩選。

1.2 診斷標準

氣滯血瘀證診斷標準參照《中醫(yī)證候鑒別診斷學》[2]、《中藥新藥臨床研究指導原則(試行)》[3]中相關(guān)的氣滯血瘀證診斷標準。

1.3 文獻納入標準

1.3.1 氣滯血瘀證診斷標準

符合研究證型符合氣滯血瘀證診斷標準的文獻均可納入。

1.3.2 文獻類型

臨床試驗、動物實驗、細胞實驗等研究類文獻均可納入。

1.3.3 研究技術(shù)

研究采用基因芯片、測序技術(shù)、qRT-PCR、免疫組化等技術(shù)檢測均可納入。

1.3.4 研究指標

DNA、RNA、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA 等組學指標均可納入。

1.4 文獻排除標準

排除：①氣滯血瘀證非主要研究證型或研究結(jié)果與氣滯血阻證無關(guān)的文獻；②綜述類文獻；③研究內(nèi)容重復文獻。

2 方法

2.1 文獻資料提取與統(tǒng)計分析

使用Excel2010 進行文獻資料的基本信息與組學信息提取。

2.2 基因形式統(tǒng)一

分別利用NCBI 基因數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），miRBase（http://www.mirbase.org/），LNCipedia（https://lncipedia.org/），circBase（http://www.circbase.org/cgi-bin/listsearch.cgi）將從文獻提取的氣滯血瘀證DNA、mRNA、Protein、miRNA、lncRNA、circRNA 統(tǒng)一為Gene symbol的形式。

2.3 基因功能富集與信號通路分析

利用The Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery（DAVID）平臺（https://david.ncifcrf.gov/）中的GeneOntology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）數(shù)據(jù)庫對氣滯血瘀證基因進行功能富集與信號通路分析。在“upload gene list”（基因列表載入）框輸入Gene symbol 形式的氣滯血瘀證基因，在"Identifier"（基因識別）點擊"OFFICIAL_GENE_SYMBOL"選項，在"List Type"（列表類型）勾選"Gene List"（基因列表），再點擊SubmitList"（提交基因列表），在下一界面中的"Gene List Manager"（基因列表管理）欄目下，“Species”（物種）選擇“Homo Sapiens”（人類），再點擊“Use”。顯示分析結(jié)果，將GO 基因富集和KEGG信號通路分析結(jié)果導出。

2.4 基因相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

利用starBase v2.0（http://starbase.sysu.edu.cn/index.php）平臺中的miRNA-target interactions 模塊（預測miRNA與靶基因關(guān)系網(wǎng)絡(luò)）、miRNA-lncRNA interactions模塊（預測miRNA 與lncRNA 關(guān)系網(wǎng)絡(luò)）、miRNAcircRNA interactions（預測miRNA 與circRNA 關(guān)系網(wǎng)絡(luò)）與STRING Version 10.5(https://string-db.org/)平臺中的Multiple proteins 模塊建立氣滯血瘀證ceRNAmRNA-protein相互作用網(wǎng)絡(luò)，并進行可視化展示。

3 結(jié)果

3.1 文獻檢索結(jié)果

本次共檢索出氣滯血瘀證相關(guān)文獻331 篇，通過閱讀篇名、摘要以及全文對文獻進行綜合篩選，最終納入41篇文獻。其中國內(nèi)期刊文獻38篇，國外期刊文獻3篇。41項納入文獻的基本信息（表1）。

3.2 基本資料分析

納入的41項研究中涉及的病種范圍較為廣泛，其中冠心病心絞痛3項，心肌梗死1項，急性冠脈綜合征1項，高血壓5項，閉塞性動脈硬化癥3項，胃癌6項，大腸癌2項，乳腺癌1項，肝癌1項，肺癌1項，高脂血癥3項，糖尿病2 項，肝纖維化3 項，潰瘍性結(jié)腸炎1 項，子宮內(nèi)膜異位癥3項，單純證候研究6項。將疾病按照臨床科屬歸類，可大致分為5類，其中心血管病領(lǐng)域研究最多，占31%，其次為癌癥，占26%，代謝性疾病占12%，消化系統(tǒng)疾病占10%，婦科疾病占7%。這一病種研究分布情況與現(xiàn)代醫(yī)學在疾病組學研究的方向基本一致，同時，也提示氣滯血瘀證在臨床分布廣泛，為常見證候。

表1 41項納入文獻的基本信息

3.3 組學研究分析

納入的41 項研究中，蛋白表達研究數(shù)量最多，有16 項，其次為mRNA 研究，有8 項，SNP 研究7 項，miRNA 研 究5 項，DNA 甲 基 化 研 究4 項，lncRNA 和circRNA 研究各1 項。從年份分布來看，2011 年以前，氣滯血瘀證組學研究以蛋白表達、mRNA和SNP為主，2011 年以后，研究豐富了DNA 甲基化以及ncRNA 的內(nèi)容，提示氣滯血瘀證候組學研究的逐步深入以及與科學前沿接軌。氣滯血瘀證已知基因組、轉(zhuǎn)錄組研究結(jié)果總結(jié)如下，（表2）。

表2 氣滯血瘀證已知基因、轉(zhuǎn)錄組研究數(shù)據(jù)總結(jié)表

表3 氣滯血瘀證基因生物過程分析

3.4 基因GO功能富集

3.4.1 生物過程(biological process，BP)分析結(jié)果

通過DAVID 平臺，對氣滯血瘀證相關(guān)基因進行GO富集BP分析，將基因富集數(shù)≥3的項目總結(jié)（表3）。

3.4.2 細胞組成(cellular component，CC)分析結(jié)果

通過DAVID 平臺，對氣滯血瘀證相關(guān)基因進行GO富集CC分析，將基因富集數(shù)≥3項目總結(jié)（表4）。

3.4.3 分子功能(Molecular Function，MF)分析結(jié)果

通過DAVID 平臺，對氣滯血瘀證相關(guān)基因進行GO富集MF分析，將基因富集數(shù)≥3項目總結(jié)（表5）。

分別將BP、CC和MF分析結(jié)果中，基因富集數(shù)目≥2，且富集得分（-log10Pvalue）排名前10的GO項目總結(jié)（圖1）。根據(jù)GO 分析結(jié)果可知，在生物過程方面，氣滯血瘀證相關(guān)基因主要與細胞對環(huán)狀化合物的反應（cellular response to organic cyclic compound）、對轉(zhuǎn)錄、神經(jīng)元凋亡基因表達的負性調(diào)控（negative regulation of gene expression）以及炎癥反應（inflammatory response）相關(guān)；在細胞組成方面，氣滯血瘀證相關(guān)基因主要與蛋白復合物（protein complex）、核質(zhì)（nucleoplasm）、細胞表面（cell surface）相關(guān)；在分子功能方面，氣滯血瘀證相關(guān)基因主要與可識別蛋白結(jié)合（identical protein binding）、酶結(jié)合（enzyme binding）、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的基因結(jié)合（transcription regulatory region DNA binding）相關(guān)。其中炎癥反應與目前氣滯血瘀證生物學基礎(chǔ)研究聯(lián)系最為密切。

3.5 基因KEGG信號通路分析

通過DAVID 平臺，對氣滯血瘀證相關(guān)基因進行KEGG 信號通路富集分析，將基因富集數(shù)≥3 項目總結(jié)（表6）。根據(jù)KEGG分析結(jié)果可知，與氣滯血瘀證相關(guān)

基因可能有關(guān)的信號通路包括腫瘤相關(guān)蛋白多糖（hsa05205：Proteoglycans in cancer）、腫瘤壞死因子信號通路（hsa04668：TNF signaling pathway）、腫瘤相關(guān)信號通路（hsa05200：Pathways in cancer）、人類T 淋巴細胞病毒感染（hsa05166：HTLV-I infection），其中腫瘤壞死因子信號通路與目前氣滯血瘀證生物學基礎(chǔ)研究聯(lián)系較為密切。

表4 氣滯血瘀證基因細胞組成分析

表5 氣滯血瘀證基因分子功能分析

圖1 氣滯血瘀證相關(guān)基因GO富集條目（Top 10）

表6 氣滯血瘀證相關(guān)基因信號通路富集

4 討論

通過生物信息學方法，分別對氣滯血瘀證相關(guān)基因進行功能注釋、GO 功能富集分析、KEGG 信號通路分析以及miRNA-mRNA-protein 相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，我們發(fā)現(xiàn)目前研究已知的氣滯血瘀證相關(guān)基因生物學功能相當廣泛，主要分為蛋白編碼與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控兩部分，其中前者編碼的蛋白種類豐富、功能多樣，后者對靶基因表達的調(diào)控也有上調(diào)與下調(diào)的區(qū)別。GO 功能富集分析結(jié)果顯示，相關(guān)基因參與轉(zhuǎn)錄和神經(jīng)元凋亡調(diào)控、炎癥反應、細胞增殖等生物過程，核質(zhì)、細胞膜、外泌體等細胞組成，具有蛋白結(jié)合、酶結(jié)合、基因結(jié)合等分子功能，其中參與炎癥反應過程與目前氣滯血瘀證生物學基礎(chǔ)研究聯(lián)系較緊密。KEGG信號通路分析結(jié)果顯示，相關(guān)RNA 主要與腫瘤相關(guān)蛋白多糖、腫瘤壞死因子、腫瘤和人類T 淋巴細胞病毒感染等多條信號通路有關(guān)，其中TNF 信號通路與氣滯血瘀證生物學基礎(chǔ)研究關(guān)系密切。

在臨床上，炎癥局部常表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛，很多中醫(yī)臨床學者認為其應歸屬于中醫(yī)“熱毒”的范疇。實際上，炎癥與氣滯血瘀的關(guān)系同樣緊密，原因包括以下幾點：①臨床表現(xiàn)，炎癥局部的腫脹，疼痛，按時加重與氣滯血瘀臨床癥狀基本一致；②病理變化，炎癥介質(zhì)誘導的血栓形成、血管內(nèi)皮損傷，局部瘀血，微循環(huán)障礙，流變學改變與氣滯血瘀的病機十分相似；③發(fā)病原因，情緒激動、壓力緊張，應激狀態(tài)是炎癥的誘因，同樣也是氣滯血瘀證的誘因，正如《靈樞·百病始生》提及：“若內(nèi)傷于憂怒則氣上逆，氣上逆則六輸不通，凝血蘊里不散”。

現(xiàn)代研究也表明，在急性冠脈綜合征、高脂血癥氣滯血瘀證患者中存在高敏C反應蛋白、白細胞介素-6、細胞間黏附分子-1、TNF-α等炎癥因子水平升高的表現(xiàn)[45-47]。動物實驗發(fā)現(xiàn)，氣滯血瘀證大鼠白細胞介素-6水平異常[48]，血瘀證家兔模型中TNF-α水平在造模后明顯升高[49]，經(jīng)活血化瘀藥物干預后，二者水平下降，側(cè)面反映了炎癥與氣滯血瘀證的內(nèi)在聯(lián)系。

另外，通過靶基因預測、蛋白作用網(wǎng)絡(luò)及拓撲分析初步構(gòu)建氣滯血瘀證miRNA-mRNA-protein 相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，由于受到目前研究數(shù)量的限制，并未在已知mRNA、miRNA 找到調(diào)控關(guān)系，而是通過已知miRNA靶基因預測尋找關(guān)鍵mRNA，并與關(guān)鍵mRNA 編碼蛋白相互作用關(guān)系構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，雖然無法完全體現(xiàn)氣滯血瘀證相關(guān)RNA內(nèi)部調(diào)控關(guān)系，但從方法學上對調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建提供了參考。

綜上，氣滯血瘀證相關(guān)基因涉及多功能、多通路，其中與炎癥反應與腫瘤壞死因子信號通路聯(lián)系最為密切，上述分析結(jié)果可為氣滯血瘀證生物學基礎(chǔ)研究帶來一些參考性的啟發(fā)，但更具體的生物學基礎(chǔ)與發(fā)生機制仍待進一步探明。