單性木蘭總黃酮的含量測定及提取條件優化

鄭燕菲 覃小靜 蔡杰慧

摘 要 對單性木蘭葉中總黃酮的含量及其提取條件進行研究。結果表明，采用硝酸鋁顯色法建立了總黃酮的定量分析方法;采用L9（34）正交試驗表優化提取條件，在最佳提取條件乙醇濃度60%、提取溫度80 ℃、料液比1∶25、提取時間150 min下，單性木蘭葉總黃酮得率為2.76%。試驗結果對瀕危植物單性木蘭成分的研究和產品開發，具有重要的指導作用。

關鍵詞 單性木蘭;總黃酮;含量測定

中圖分類號：R284.2 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.14.065

單性木蘭，為木蘭科單性木蘭屬，是我國特有的珍稀瀕危植物，僅分布于我國西南地區，在廣西壯族自治區已有人工種植林。單性木蘭葉化學成分的研究只有揮發油、多糖和多酚等，而總黃酮的研究鮮見報道。若能把瀕危植物單性木蘭葉作為原料，提取獲得天然的黃酮類化合物，開發成為天然的抗氧化劑和具有保健功能的食品添加劑，對提高該植物的綜合利用價值具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料：新鮮單性木蘭葉摘自廣西壯族自治區南寧市武鳴區，經廣西大學林學院賴家業教授鑒定為木蘭科單性木蘭屬植物單性木蘭。

試劑：蘆丁為標準品;石油醚、無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉以及硝酸鋁等試劑均為分析純;試驗用水為蒸餾水。

儀器：DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，RE-3000B旋轉蒸發器，AR224CN型電子天平，722型分光光度計。

1.2 試驗方法

1.2.1 蘆丁標準曲線的繪制

向5支10 mL容量瓶中準確移入0.131 0 mg·mL-1的蘆丁標準溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，分別加入0.72 mol·L-1 NaNO2溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min，再分別加入0.47 mol·L-1 Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min，加入1 mol·L-1 NaOH溶液4.0 mL搖勻，用蒸餾水定容至刻度，搖勻并靜置15 min，在510 nm波長處測定吸光值，并繪制標準曲線。

1.2.2 單性木蘭葉總黃酮提取液的制備

將新鮮單性木蘭葉洗凈、干燥、粉碎，取適量粉末于圓底燒瓶中，加入料液比為1∶4 g·mL-1的石油醚，于70 ℃回流240 min脫色除脂，揮去溶劑、烘干得單性木蘭葉脫脂原料;稱取一定量的單性木蘭葉脫脂原料置于250 mL圓底燒瓶內，加入一定料液比的不同溶劑，在不同溫度條件下加熱回流一定時間后，離心，過濾，上清液即為單性木蘭葉總黃酮提取液。

1.2.3 單性木蘭葉總黃酮的含量測定

分別移取不同的單性木蘭葉總黃酮提取液1.0 mL，按照1.2.1的操作測定吸光值，計算單性木蘭葉總黃酮的得率。

1.2.4 單性木蘭葉總黃酮工藝優化

考察乙醇濃度、料液比、提取溫度和提取時間4個因素對單性木蘭葉總黃酮得率的影響，計算總黃酮得率。準確稱取單性木蘭葉脫脂原料5.0 g，分別以乙醇濃度（50%、60%、70%、80%、95%）、液料液比（1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40）、提取溫度（50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃）以及提取時間（60 min、90 min、120 min、150 min、180 min）為影響因素進行試驗。

利用單因素試驗的結果，選擇4個提取因素（A：乙醇濃度;B：料液比;C：溫度;D：時間）進行L9（34）正交試驗，并進行方差分析，確定單性木蘭葉總黃酮提取的最佳條件。

2 結果與分析

2.1 定量方法的確定

以蘆丁標準溶液的質量濃度X為橫坐標，吸光值Y為縱坐標，繪制蘆丁標準曲線，并進行線性擬合，結果為蘆丁標準溶液在質量濃度0.013 1～0.065 5 mg·mL-1范圍內與吸光值呈良好的線性關系，線性方程為Y=13.847X+0.003 2，R2=0.999 8。經精密度、穩定性及加標回收試驗。

2.2 單因素試驗結果

單因素試驗結果如圖1所示。單性木蘭葉總黃酮得率隨著乙醇濃度的增大呈先升后降的趨勢，乙醇濃度為70%時達到最大。黃酮類物質的溶解性與溶劑極性有關，當乙醇與水的比例適宜時，總黃酮的溶解度最大，故選70%的乙醇作為最佳溶劑。總黃酮的得率隨著料液比的增大而增大，溶劑的量越大，細胞里外濃度差越大，黃酮類物質越容易被提取。當料液比為1∶30時得率達到最大，之后得率不再變化。所以，從節約成本、試驗操作方面考慮，選擇料液比為1∶25為最佳提取液固比。單性木蘭葉中總黃酮的得率隨著溫度的升高而增大，當溫度達到70 ℃時得率達到最大值，70 ℃后得率逐漸降低。這是因為溫度過低黃酮類物質不易被溶出，而溫度過高黃酮類物質會發生氧化、縮合等化學反應，故選擇70 ℃作為提取的最佳溫度。總黃酮的得率隨著時間的增大而增大，提取時間為120 min時得率達到最大，超過120 min后得率保持不變，故選擇120 min作為最佳的提取時間。

2.3 正交試驗結果

L9（34）正交試驗安排與結果，如表1所示。

由表1可知，影響單性木蘭葉中總黃酮得率的4個因素的主次順序是：A>C>B>D。單性木蘭葉中，總黃酮的最佳提取條件為A1C3B2D3，即乙醇濃度60%、提取溫度80 ℃、料液比1∶25、提取時間150 min。在此最佳條件下進行驗證，平行提取5次，提取率分別為2.74%、2.76%、2.76%、2.74%和2.78%，平均值為2.76%，且RSD值為0.61%，說明正交試驗結果準確可靠。

3 結論與討論

以蘆丁為標準品，采用硝酸鋁顯色法建立總黃酮的定量分析方法，得標準曲線方程Y=13.847X+0.003 2;采用L9（34）正交試驗設計方法優化提取條件，得單性木蘭葉總黃酮最佳提取條件為乙醇濃度60%、提取溫度80 ℃、料液比1∶25、提取時間150 min。在此條件下，單性木蘭葉總黃酮得率為2.76%。本試驗首次對單性木蘭葉總黃酮含量進行測定及其提取工藝進行優化，具有一定的前瞻性，為瀕危植物單性木蘭的進一步研究和開發奠定了基礎。

（責任編輯：劉昀）