構象可控DNA-金納米粒子復合材料的制備與表征

王 棒，曹行行

（合肥工業大學化學與化工學院，安徽合肥230009）

金納米粒子具有良好的穩定性[1]和生物相容性[2]以及特殊的納米尺寸效應[3]，一直以來都是研究和應用的熱點。DNA 納米技術[4]提供了一種自下而上（bottom-up）程序化構建納米材料的新方法。DNA 功能化金納米粒子（AuNP）不僅具有AuNP 的光學和物理化學特性，而且擁有可編程組裝能力以及生物相容等性質。目前，DNA-AuNP 復合材料已經被廣泛應用于生物傳感[5]、膠體晶體組裝[6-7]、生物成像[8]等領域，但是大部分報道中的組裝方法比較復雜且產物產率不高，對組裝機制的探索仍然較少。為此需要努力探索更直接的組裝方法和更明確的組裝機制。

本文基于DNA 納米技術，實現巰基DNA（Y1-thiol）和金納米粒子的連接，并利用瓊脂糖凝膠電泳（AGE）成功提取“單價態”產物，然后與DNA 模塊中另外兩條單鏈退火組裝，即可介導金納米粒子形成特定的離散結構。通過改變模塊翻轉角度等因素制備了正四面體、正八面體構象可控的金納米粒子寡聚結構。透射電子顯微鏡（TEM）照片證實金納米粒子寡聚結構的存在。結果表明，13 nm 的金納米粒子的四聚體產率可達60.02%。

1 實驗部分

1.1 儀器和藥品

DYY-6C 型電泳儀；調溫萬用電爐；24 DN 制膠器；場發射透射電子顯微鏡（TEM）。

瓊脂糖（Agarose B），氯化鈉（NaCl），氯金酸（HAuCl4），三（2-羧乙基）膦（TCEP），醋酸鎂（（CH3COO）2Mg·4H2O），尿素（Urea）等。

1.2 實驗方法

（1）DNA 序列及組裝模塊示意圖（圖1）

圖1 DNA 序列及組裝模塊示意圖

（2）DNA 修飾金納米粒子

先用變性凝膠對相關3-arm tile DNA 進行純化，之后在紫外260 nm 處定量DNA 濃度。取適量的Y1-thiol鏈與TCEP 在0.5×TBE 緩沖液中混合作用30 min 左右，TCEP 與DNA 的摩爾計算比應大于200。將DNA 溶液與一定量的金納米溶液相混合（通常DNA∶Au5NPs=1∶1，DNA∶Au13NPs=2∶1），緩沖體系是0.5×TBE。

（3）單價態DNA-AuNPs 的提取

將上一步得到的DNA-AuNPs 產物，在瓊脂糖凝膠中進行電泳。首先在膠中切取“一價態”條帶，接著利用電洗脫技術，提取出“單價態”產物，即金納米表面只連接了一條Y1-thiol 鏈。運用逐漸加鹽老化的方法，添加1.0 M NaCl 使混合液中NaCl 濃度依次達到50 mM、100 mM、200 mM、300 mM、500 mM，間隔時間2～3 h。

（4）慢速退火組裝

根據紫外光下最大吸收波長520 nm 處的吸收峰值，按照朗伯-比爾定律計算出“AuNPs-Y1-thiol”的濃度。在1×TAE/Mg2+緩沖液中，添加3-arm tile 的其余兩條鏈，按照一定的模塊濃度（4.0 turn-100 nM，4.5 turn-50 nM），進行60℃～4℃慢速退火組裝。

（5）濃縮提取樣品

使用超濾管在2 000 rpm 的轉速下離心5～7 h 處理樣品；在瓊脂糖凝膠中將組裝產物與Y1-AuNPs 進行速率對比，切取目標產物條帶，進行電洗脫操作。所有操作在4℃環境下進行，確保產物穩定不破碎。

1.3 TEM 表征

對于電洗脫得到的產物，取5 μL 滴在銅網上靜置10 min，放置在空氣中自然晾干轉移至樣品盒里；利用TEM表征金納米粒子的組裝情況。

2 結果與討論

圖2 是5 nm AuNP-DNA 復合物的瓊脂糖凝膠電泳分離膠圖。泳道1 是裸金（沒有加入巰基鏈Y1SH），泳道2～5 分別為加入不同Y1SH 修飾得到的AuNP-DNA 復合物。根據膠圖結果可得知，分離得到了5 個不同DNA價態的AuNP-DNA 復合物，根據電泳速率由快至慢（凝膠中順序為自下而上）依次為 AuNP-DNA1、AuNP-DNA2、AuNP-DNA3、AuNP-DNA4、AuNP-DNA5。其中，AuNP-DNA1、AuNP-DNA2、AuNP-DNA3 三種價態產物在圖2 中已經利用圖形標記出。切取AuNP-DNA1 電泳條帶，裝入透析袋中進行電洗脫純化處理。對于AuNP-DNA1 而言，單條DNA 修飾的金納米粒子復合物不能承受較高的鹽濃度，因此，采用室溫條件下逐漸加鹽老化修飾短鏈DNA 的方法，增強其穩定性。首先，根據吸收光譜測定了AuNP-DNA1 的濃度，然后加入合適比例T5-thiol 短鏈以保證金納米不會在高濃度鹽溶液中團聚，對于AuNPs 來說，T5-thiol 均為過量。其中對于Au5NPs 來說，T5-thiol 的摩爾濃度為金納米粒子的100 倍；對Au13NPs 來說，T5-thiol 的摩爾濃度為金納米粒子的300 倍。加鹽老化之后，再次根據吸收光譜定量AuNP-DNA1 的濃度。

圖2 5 nm AuNP-DNA 復合物的瓊脂糖凝膠電泳分離膠圖

4Au5NP@TET 的瓊脂糖膠圖表征如圖3（a）所示。其中，4 Au5NP 表示為5 nm 金納米粒子四聚體，@TET 表示為四面體構象。圖3（a）中，泳道1 是Au5NP-DNA1 樣品，作為對照，泳道2 是4Au5NP@TE 退火組裝樣品，泳道3 是4Au5NP@TET 溶液樣品經過超濾離心得到的濃縮樣品。通過對比泳道1 與泳道2、3 的電泳速率，發現泳道2、3 中樣品電泳速率明顯慢于泳道1 中樣品，因此，可以初步判斷泳道2、3 中樣品為金納米粒子寡聚組裝體。通過對比泳道2 與泳道3 中樣品電泳速率，發現超濾離心濃縮處理對金納米粒子組裝樣品的破壞作用很小，進而排除了濃縮操作對組裝樣品的影響。

圖3（b）是4Au5NP@TET 目標產物的TEM圖。根據TEM結果可以看出，主要的產物為金納米粒子四聚體。在TEM圖片上沒有發現金納米粒子的較大聚集體。這與DNA 輔助金納米粒子“根據DNA 三分支模塊的組裝路徑”形成四面體構象結構的設計思路相符。透射電鏡的表征結果充分證實了組裝思路是正確可行的。

圖3 4Au5NP@TET 產物的瓊脂糖膠圖表征（a）及TEM 表征（b）

采用相同的Au5NP-DNA1 樣品（即相同的DNA 中心鏈Y1SH），加入另外一組DNA 短鏈，可以得到不同構象的金納米粒子寡聚結構。加入兩條鏈（M2、S3）能夠與金納米粒子表面的DNA 鏈Y1SH 形成立方體結構，所得金納米粒子寡聚結構為正八面體構象。組裝過程如前，瓊脂糖凝膠電泳表征結果如圖4（a）所示。該類組裝產物標記為8Au5NP@Cube。其中，8Au5NP 表示為5 nm金納米粒子八聚體，@Cube 表示為正八面體構象。圖4（a）中，泳道1 是Au5NP-DNA1 樣品，泳道2 是4Au5NP@TET 退火組裝樣品，泳道3 是8Au5NP@Cube組裝樣品。觀察泳道2 和3，利用M2、S3 短鏈組合制備得到了更大的金納米粒子寡聚結構。切取泳道3 中的“目標”條帶，然后在1×TAE/Mg2+緩沖液中進行電洗脫操作，用移液槍依次取5 μL 樣品至銅網，靜置10 min，再采用透射電子顯微鏡進行表征。圖4（b）是8Au5NP@Cube 產物的透射電子顯微圖。TEM結果表明，在DNA 鏈（M2、S3）輔助下，金納米粒子可以組裝得到八聚體。這一點也證實了實驗的設計，利用DNA 相互連接，便可得到正八面體構象的金納米粒子寡聚結構。

圖4 8Au5NP@Cube 產物的瓊脂糖膠圖表征（a）及TEM 表征（b）

我們進一步構筑了具有四面體構象的Au13NP 寡聚組裝結構。瓊脂糖凝膠電泳表征結果如圖5（a）所示。為方便區分，該類組裝產物分別標記為4Au13NP@TET（4bp）、4Au13NP@TET（6bp），其中，4 Au13NP 表示為13 nm 金納米粒子四聚體，@TET 表示為四面體構象，（4bp）（6bp）表示模塊粘性末端長度為4、6 個堿基對。圖4（a）中，泳道1 是Au13NP-DNA1，泳道2 是4Au13NP@TET（4bp），泳道3 是4Au13NP@TET（4bp）離心濃縮樣品，泳道4 是4Au13NP@TET（6bp），泳道5 是4Au13NP@TET（6bp）離心濃縮樣品。通過對比泳道1 與2～5 中條帶電泳速率，認為泳道2、3 中主要形成三個不同組裝產物條帶，根據電泳速率從快到慢，分析認為可能為Au13NP二聚體、三聚體、四聚體。泳道4、5 中，三種組裝產物中的二聚體比例最高。分析認為，由于TET（6 bp）相較TET（4 bp），其粘性末端堿基配對數目增加，使得模塊間相互作用增強，因此，容易導致形成較小的聚集結構，即二聚體。此外，相比于4Au5NP@TET，4Au13NP@TET（4bp）組裝過程中出現了二聚、三聚的現象，分析認為可能由于金納米粒子粒徑增大，導致粒子間的空間位阻增大。圖5（b～d）是三種組裝體的TEM表征結果。透射電子顯微圖表明，電泳速率從快到慢的三個條帶產物依次為Au13NP 二聚體、三聚體與四聚體。根據TEM表征結果對4Au13NP@TET（4bp）四聚體產物（圖5（d）樣品）做統計分析：統計了748 個Au13NP 組裝體，其中四聚體有450 個，產率達到了60.02%。

圖5 4Au13NP@TET 組裝產物瓊脂糖凝膠電泳分析膠圖（a）及TEM 表征（b～d）

3 結論

本文基于DNA 納米技術，實現巰基DNA（Y1-thiol）和金納米粒子的連接，并利用瓊脂糖凝膠電泳（AGE）成功提取“單價態”產物，然后與DNA 模塊中另外兩條單鏈退火組裝，即可介導金納米粒子形成特定的離散結構。通過改變模塊翻轉角度等因素制備了正四面體、正八面體構象可控的金納米粒子寡聚結構。透射電子顯微鏡（TEM）照片證實金納米粒子寡聚結構的存在。結果表明，13 nm 的金納米粒子的四聚體產率可達60.02%。該過程簡化了金納米粒子多聚體的制備方式，且只要通過“一價態”Y1-AuNPs 與不同DNA 結合，即可實現不同構象的組裝，這是DNA 自組裝領域一大突破。