結直腸癌患者血漿circPRMT5表達水平及臨床意義

王洪偉 王琳琳 張翼飛 于永生 劉玉偉 李重 劉欣然

結直腸癌是高發病率和高死亡率的消化系統惡性腫瘤［1］。早期發現、早期診斷成為改善結直腸癌治療效果的重要手段。血漿中非編碼RNA分子的檢測，能夠有助于腫瘤的早期診斷［2］。環狀RNA（circRNA）是一類新發現的非編碼RNA分子，是具有閉環結構的小RNA分子［3］。circRNA分子形成的機制主要包括“外顯子跳躍”和前體mRNA的“反向剪切”兩種方式［4-5］。盡管很早就有研究發現了真核細胞中存在circRNA分子，但是早期的理論認為circRNA分子是無功能的“垃圾”分子。近些年來，隨著深度測序技術的不斷應用，人們發現了大量的外顯子或內含子circRNA，這說明了circRNA并不是錯誤剪切的產物，而是具有多種調控功能的RNA分子［2］。circRNA因為其獨特的環狀結構，使得其不易降解，是具有前景的分子標志物。已經有研究發現了血漿中的circRNA分子與患者的生存密切相關［6］。這提示我們血漿circRNA可以作為潛在的分子標志物。

本文通過高通量芯片技術對結直腸癌患者血漿circRNA分子進行篩選，發現circPRMT5在結直腸癌患者血漿中高表達。同時，我們發現血漿circPRMT5與結直腸癌患者的生存密切相關，也是預測結直腸癌患者預后的獨立因素。因此，本研究發現血漿circPRMT5是結直腸癌腫瘤中新的分子標志物。

資料與方法

一、血漿樣本與臨床信息

276例非轉移性結直腸癌患者與37例正常人群血漿樣本來源于2012年1月至2013年1月哈爾濱醫科大學附屬第四醫院普外科，正常人群均經過腸鏡證實無腸道腫瘤。所有患者經腸鏡檢查，病理明確為腺癌，肝臟MRI和肺臟CT排除患者遠處器官轉移。所有患者臨床信息完整，定期隨訪。總生存時間定義為患者確診結直腸癌日期至患者死亡日期，無復發生存時間定義為患者確診結直腸癌日期至第一次診斷復發日期。在確診之后，手術之前，獲得10 mL患者血液樣本，3 000 rpm離心后，分離獲得血漿成分，分裝后，液氮速凍，置于-80 ℃冰箱中保存。腫瘤TNM分期根據第六版UICC腫瘤分期標準。本研究經過哈爾濱醫科大學附屬第四醫院倫理委員會批準，所有實驗過程符合赫爾辛基宣言，并且在實驗開始前所有患者均簽署知情同意書。

二、血漿RNA的提取

使用Qiagen公司miRNeasy Serum Plasma Advanced Kit試劑盒。取200 μL血漿，加入60 μL RPL緩沖液，渦旋至少5秒后，室溫下靜置3 min。加入20 μL RPP緩沖液，渦旋至少20 s后，室溫下靜置3 min。室溫下12 000 g離心3 min，棄掉沉淀，將上清轉移到新的離心管中，加入1倍體積的異丙醇，渦旋充分混勻；將全部混合液轉移到RNeasy UCP MinElute柱中，8 000 g離心15 s，棄掉穿流液；向RNeasy UCP MinElute柱加入700 μL RWT緩沖液，8 000 g離心15 s，棄掉穿流液；向RNeasy UCP MinElute柱中加入500 μL RPE緩沖液，8 000 g離心15 s，棄掉穿流液；向RNeasy UCP MinElute柱 中 加 入 500 μL 80% 的 乙 醇，8 000 g離心2 min，棄掉穿流液；將RNeasy UCP MinElute柱置于2 mL新的收集管中，8 000 g離心5 min，棄掉穿流液和收集管；將RNeasy UCP MinElute柱置于1.5 mL的收集管中，加入20 μL無RNA酶水，室溫孵育1 min，8 000 g離心1 min，洗脫RNA。

三、RNA的提取和芯片雜交

根據ArrayStar公司標準。提取RNA后，經過RnaseR消化去除線性RNA，使用Arraystar Super RNA Labeling Kit試劑盒擴增并熒光標記circRNA分子。而后，將標記的circRNA分子與ArrayStar人類circRNA分子芯片雜交，之后使用Agilent Scanner G2505C掃描芯片。芯片圖像使用Agilent Feature Extraction軟件分析，表達倍數大于2并且P值小于0.05認為是具有差異表達的circRNA。所有患者每1個月規律電話隨訪，詢問患者生存狀態與復發狀態。無復發生存時間定義為手術日期至第一次臨床確診復發日期之間的時間間隔，刪失數據定義為手術日期至幸存者最后一次隨訪日期之間的時間間隔。

四、統計學分析

所有統計學分析使用SPSS 23.0。circPRMT5與患者臨床病理參數之間的關系，采用卡方檢驗；計數參數之間的比較，采用獨立樣本t檢驗或者非參數檢驗。總生存時間和無復發生存時間之間的比較，采用Kaplan-Meier和對數秩檢驗法，預后相關的獨立因素分析，采用COX回歸分析；P＜0.05認為差異具有統計學意義。

結 果

一、結直腸癌患者血漿circRNA表達譜

為了研究結直腸癌患者血漿circRNA的差異表達，我們采用了circRNA芯片技術，分析比較了5例結直腸癌患者血漿與5例正常人群血漿circRNA的表達情況。差異circRNA的表達如火山圖所示（圖1），我們共篩選獲得到31個高表達的circRNA分子和38個低表達的circRNA分子。在高表達circRNA中，有26個外顯子circRNA，3個內含子circRNA和2個反義circRNA分子；在低表達circRNA中，有25個外顯子circRNA，6個內含子circRNA，5個基因間circRNA和2個反義circRNA分子。我們選取了在結腸癌患者血漿中表達最高的circPRMT5作為后續研究的目標分子。而后收集了276例結直腸癌患者的血漿和37例正常人群的血漿，通過PCR技術檢測證實，circPRMT5在結直腸癌患者血漿中高表達，為10.33±3.41；正常人群為8.77±3.74（t=2.58，P=0.01）。

圖1 circRNA表達火山圖

二、研究人群的一般特征

我們收集了本科室276例結直腸癌患者的血漿樣本，通過PCR的方法檢測了circPRMT5的表達，根據表達量的中位值，將人群分為高表達組和低表達組。比較了年齡、性別、腫瘤TNM分期、淋巴結清掃數目、血管瘤栓、淋巴管瘤栓和神經侵犯等病理指標。通過比較發現circPRMT5高表達組患者的年齡更高，男性患者比例較多。circPRMT5高表達組患者腫瘤分期更晚，淋巴結轉移數目越多，并且不良預后相關的病理因素更多（表1）。

三、circPRMT5是預測結直腸癌患者不良預后的獨立因素

為了進一步研究circPRMT5在結直腸癌患者中的臨床意義，我們對276例患者進行了隨訪，中位隨訪時間為38個月，通過Kaplan-Meier生存曲線，比較了circPRMT5高表達組與低表達組之間的生存差異，發現高表達circPRMT5的患者生存時間明顯短于低表達circPMRT5組患者（圖2，Log rank P=0.006）。同時高表達circPRMT5的患者的無復發生存時間明顯短于低表達circPRMT5（圖3，Log rank P=0.025）。進一步尋找影響患者生存的因素，我們采用了單因素和多因素COX回歸分析，通過分析我們發現circPRMT5的表達水平是判斷患者總生存時間與無復發生存時間的獨立危險因素（表2）。

表1 患者一般病理特征（例）

圖2 患者總生存時間的比較

圖3 患者無復發生存時間的比較

表2 circPRMT5表達水平是患者總生存時間與無復發生存相關的獨立危險因素

討 論

在本研究中，通過circRNA芯片篩選我們發現了circPRMT5在結直腸癌患者血漿中顯著高表達。在更大量人群樣本中，通過進一步驗證，我們證實了circPRMT5在結直腸癌患者血清中高表達，提示circPRMT5可能是結直腸腫瘤患者的臨床標志物。結合人群的臨床病理學特征，高表達circPRMT5提示了更差的臨床預后，并且與預后不良的病理學指標相關。通過多因素COX回歸分析，我們發現circPRMT5是提示患者不良預后的獨立因素。

目前越來越多的研究顯示circRNA是重要的非編碼RNA分子，發揮了多種多樣的生物學調控作用。不僅如此，circRNA特有的更加穩定的閉環結構，使其成為更加有潛力的臨床標志物。目前已經有多項研究發現，血漿circRNA分子能夠作為診斷疾病的分子標志物［7-9］。血漿circRNA0004904/0001855能夠作為診斷孕婦子癇的、新的血漿分子標志物［10］；血漿中的circRNA還能作為判斷糖尿病視網膜病變的分子標志物［11］。在腫瘤患者血漿中可以檢測到circRNA分子的表達，這些研究還發現了circRNA分子是具有很強的臨床診斷意義［12-13］。crcRNA0000285的表達水平與鼻咽癌患者的預后明顯相關，同時也和鼻咽癌患者對放療的敏感性密切相關［14］。circ0004018在肝癌組織中高表達，是肝細胞肝癌患者預后相關的重要分子標志物［15］。circPRMT5在前列腺癌患者血漿中高表達，能夠促進前列腺癌細胞的上皮間質轉化，促進前列腺癌的轉移［16］。我們的研究發現在結直腸癌患者血漿中，circPRMT5顯著高表達。更為重要的是，我們的研究發現了circPRMT5是重要的臨床分子標志物。通過我們的分析發現了，circPRMT5的高表達組患者中，腫瘤分期更晚，淋巴結轉移數目更多，提示預后不良的病理因素也更多。通過生存分析，我們還發現與低表達組患者相比，高表達circPRMT5的患者的總生存時間和無復發生存時間更短；經過單因素和多因素的COX回歸分析，我們發現了circPRMT5的表達水平，是預測患者總生存和無復發生存的獨立危險因素。由此，我們發現了circPRMT5是結直腸癌中重要的分子標志物。

綜上所述，我們的研究發現circPRMT5在結直腸癌患者血漿中高表達，同時也是重要的臨床分子標志物。circPRMT5與患者的腫瘤分期，淋巴結轉移數目等相關病理學指標密切相關。高表達circPRMT5也不良預后的獨立危險因素。我們的研究發現結直腸癌患者中新的血漿分子標志物，為結直腸癌患者早期診斷和預后判斷方面帶來新的思路。