miRNA-1236通過靶向FOXO3a調控結直腸癌細胞增殖的作用及機制研究

孫宇 朱琳 劉禎璐 楊明 余貞 孫靜 王妍 蔣雨含 李紅巖 孫輝,4

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）在中國癌癥發病率中排名第二，世界癌癥發病率排名第三，是導致癌癥相關死亡的主要原因之一［1］。在亞洲，尤其是在發展中國家，CRC的發病率在1998年至2007年間迅速上升，已經嚴重威脅人類健康［2］。

叉頭轉錄因子O亞家族3a（FOXO3a）是FOXO家族的抑癌基因，可以調控多種參與細胞增殖、細胞周期和凋亡的基因，如BIM（細胞死亡的Bcl-2相互作用介質），PUMA（p53上調凋亡調控因子），CKI（細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑），p27Kip1，cyclin D1（細胞周期蛋白依賴性激酶D1）。它控制著腫瘤細胞的各種信號通路和多種生物學過程［3］。FOXO3a表達降低與乳腺癌、胰腺癌、肝癌、膀胱癌等多種腫瘤的發生、進展和耐藥有關［4-7］。同時有研究報道在CRC中FOXO3a表達異常降低，提示其可能具有抑癌作用［8-9］。

MicroRNAs（miRNAs）是一種非編碼小RNA分子，通過部分序列同源性結合到哺乳動物mRNA的30個未翻譯區域（3′UTR），并引起蛋白質翻譯抑制或mRNA降解，或兩者都發生，從而在轉錄后水平調控基因表達［10］。同時有研究表明miR-1236，可通過ceRNA作用方式參與LncRNA FAL1促進肝癌細胞增殖［11］。其在結直腸癌中有無作用尚無明確報道，本實驗旨在證明FOXO3a為miR-1236的靶基因，為進一步闡明miR-1236在腫瘤信號通路中發揮的調控作用奠定基礎。

材料和方法

一、材料

收集2018年1月至2018年6月哈爾濱醫科大學附屬第二醫院10例經病理學確診為結直腸腺癌患者的癌組織和癌旁組織，所有實驗都遵照哈爾濱醫科大學倫理委員會的相關規定進行收集。

二、實驗方法

本研究通過http://ualcan.path.uab.edu/網站獲取了TCGA數據庫中FOXO3a在結直腸癌患者中各種樣本的表達。本研究檢測了FOXO3a基因在癌-癌旁，不同腫瘤階段與不同性別中的表達。

（一）細胞培養及轉染

人結直腸癌HCT116細胞在5%CO2、37 ℃孵箱中培養，加入10%的胎牛血清，100 ug/mL的抗生素（青霉素，鏈霉素）。依據不同處理方法，分為5組：（1）對照組（空白對照）；（2）陰性對照組1（轉染不含miR-1236 mimics的脂質體）；（3）miR-1236 mimics組（轉染含miR-1236 mimics的脂質體）；（4）陰性對照組2（轉染不含miR-1236 inhibitor的脂質體）；（5）miR-1236 inhibitor組（轉染含miR-1236 inhibitor的脂質體），通過Lipofectamine?3000轉染到HCT116細胞中，經過48 h后收集各組細胞進行相關實驗。

（二）免疫組織化學實驗

取結直腸癌組織做成組織切片，一抗于4 ℃用微量離心機以1 500轉離心2 min，室溫孵育1 h，完成后用PBS清洗3次，每次5 min。二抗于4 ℃用微量離心機以1 500 轉離心2 min，室溫孵育1 h，完成后PBS清洗3次，每次5 min。將蓋玻片放于紙巾上，滴加1滴Gelvatol于蓋玻片中央。翻轉載玻片放于蓋玻片上，勿施壓。將玻片置工作臺上，用鋁箔覆蓋避光放置30 min，使Gelvatol凝結。顯微鏡觀察結果。

（三）蛋白免疫印跡法

將含蛋白酶抑制劑（羅氏，瑞士）和RIPA裂解液加入細胞培養皿中，裂解細胞，超聲破碎3次后，13 500轉/min（4 ℃）離心12 min并收集上清液。利用BCA法進行蛋白定量。通過12.5% SDS-PAGE分離等量的蛋白質并轉移到醋酸纖維素膜上（Pall公司，美國）。室溫封閉后1 h后，分別與一抗β-actin（1:1 000，Cell Signaling Technology，USA），PCNA（1:1 000，Cell Signaling Technology，USA），Bax（1:1 000，Cell Signaling Technology，USA）和 FOXO3a（1:500，萬類生物，中國）于4 ℃冰箱中孵育過夜。PBST洗滌3次，每次15 min后，分別用抗兔或抗鼠二抗（1:10 000）室溫孵育1 h。通過理光公司的紅綠熒光顯色進行發光。

（四）CCK-8細胞活性檢測

本研究選用CCK-8細胞活性試劑盒（碧云天，上海，中國）來檢測轉染miR-1236后HCT116細胞的活性。首先，將約5×104個細胞接種于96孔板中。當達到所需匯合程度后，將細胞放在37 ℃的5% CO2培養箱中分別轉染miR-1236 mimic和miR-1236 inhibitor及其相應的陰性對照48 h后，按照CCK-8操作流程進行實驗，并在酶標儀中測量490 nm處的吸光度，使用以下公式計算細胞活力百分比：

細胞活力的百分比=（實驗樣本的吸光度/對照的吸光度）×100%。

（五）克隆形成

將8×102個HCT116細胞培養于6 cm培養皿中14天后。棄去培養基，并用PBS漂洗。用20%甲醇固定，用0.1%結晶紫染色，棄去上膜表面細胞。統計超過100個細胞組成的菌落為計數單位。在顯微鏡下隨機選取五個區域的細胞進行拍照和計數。

（六）Ki-67 免疫熒光

HCT116細胞接種于含有無菌蓋玻片的6孔板中，分別轉染miR-1236 inhibitor以及其miR-inhibitor NC 48 h后。將Ki-67（Cell Signaling Technology，美國）抗體孵育1 h后，加入熒光顯色劑Alexa-488在室溫孵育20 min。然后，用DIPA染細胞核。通過免疫熒光顯微鏡進行拍攝。

（七）RNA提取和實時定量PCR

采用Trizol試劑提取總RNA（Invitrogen公司，美國）。利用superscriptase II（Invitrogen公司，美國）逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA。實時定量PCR法檢測miR-1236表達水平。實時定量PCR采用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒（Life Technologies， 美 國），PCR儀 為ABI 7500實時定量PCR儀（ABI，美國），PCR擴增條件為：95 °C 變性 30 s，60 °C 退火 30 s，72 °C延伸35 s，共30個循環。以下引物用于實時熒光 定 量 PCR 檢 測：miR-1236-F：5′-UCUGGCU CCGUGUCUUCAC UCCC-3′；miR-1236-R：5′-UUCUCCGAACGUG UCACGU-3′；GAPDH-F：5′-CCTGCACCACCAACTGCTTA-3′；GAPDH-R：5′-GGCCATCCACAGTCTTCTGG-3′。

（八）Luciferase基因分析報告

將5×103個HCT116細胞接種于96孔板，24 h后，通過lipofectamine 2 000共轉染pmirglo-FOXO3-wt或 pmirglo-FOXO3-mut＋ miR-1236或miR-mimic NC。48 h后收集相應的細胞，按照luciferase報告實驗流程進行檢測熒光素酶活性。

三、統計學分析

采用SPSS19.0進行統計分析，GraphPad Prism 5.0軟件處理。實驗數據均以3～6次實驗結果的平均數±標準誤（mean±SD）表示。所有數據采用配對t檢驗的方法進行統計，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、miR-1236對于結直腸癌細胞HCT116活性的影響

為了研究miR-1236在結直腸癌中的作用，本研究首先通過qRT-PCR方法檢測轉染miR-1236 mimic以及inhibitor后miR-1236的表達，本研究發現miR-1236 inhibitor組相對于陰性對照明顯降低，而miR-1236 mimic組相對于陰性對照，其表達明顯升高（圖1A）。隨后，本研究通過CCK-8方法檢測miR-1236對于HCT116細胞活性的變化，低表達miR-1236后能夠明顯降低HCT116的活性，而高表達miR-1236能夠促進HCT116細胞的活性增加（圖1B）。同時通過克隆形成實驗進一步驗證了miR-1236對于HCT116細胞活性的變化，發現其結果與CCK-8結果相同（圖1C）。隨后，通過Ki67實驗檢測低表達miR-1236后，HCT116細胞增殖能力的變化，結果顯示，miR-1236 inhibitor組細胞增殖能力相對于NC對照組明顯降低（圖1D）。同時，本研究檢測了增殖相關蛋白PCNA以及BAX蛋白的變化，發現轉染miR-1236 inhibitor后相對于NC對照組，miR-1236 inhibitor 組中PCNA以及BAX蛋白明顯下調（圖1E～1F）。以上的結果說明，miR-1236能夠調節HCT116細胞的活性，同時能夠影響HCT116細胞的增殖。

圖1 miR-1236對于結直腸癌細胞HCT116活性的影響。1A：逆轉錄實時定量PCR檢測轉染miR-1236mimic或者miR-1236inhibitor后miR-1236的表達；1B：CCK-8檢測轉染miR-1236后HCT116細胞的活性變化；1C：克隆形成檢測轉染miR-1236后HCT116細胞的活性變化；1D：ki-67檢測低表達miR-1236對于HCT116細胞增殖能力的影響；1E～1F：Western blot 檢測低表達miR-1236對于HCT116細胞中PCNA 以及Bax蛋白的變化，與對照組相比*P＜0.05

二、miR-1236通過靶向調節FOXO3參與HCT116細胞增殖

為了進一步研究miR-1236對于結直腸癌增殖能力的影響，本研究首先通過生物信息學網站（www.targetscan.org）尋找miR-1236的潛在作用靶點，發現miR-1236與FOXO3有潛在的結合位點（圖2A）。同時，luciferase報告結果顯示，轉染miR-1236-mimic可明顯抑制FOXO3a-wt組的熒光素酶活性，而對FOXO3-Mut組沒有作用（圖2B）。隨后，通過免疫蛋白印記方法以及實時定量PCR方法檢測分別轉染miR-1236-mimic或inhibitor后，FOXO3a蛋白以及mRNA的變化，結果顯示，miR-1236-mimic組相對其NC組能夠明顯降低FOXO3a蛋白以及mRNA的表達，而轉染miR-1236-inhibitor后，FOXO3蛋白以及mRNA水平顯著上調（圖2C～2D）。以上的結果說明，miR-1236與FOXO3a存在靶向調節作用。

三、FOXO3對于結直腸癌的作用

既然，FOXO3a是miR-1236的靶基因，進而影響HCT116增殖能力的變化，那么，FOXO3a在結直腸癌的作用到底是什么呢?本研究通過TCGA網站檢測了FOXO3a在結直腸癌中的作用，本研究發現，FOXO3a在結直腸癌組織中相對于正常組織明顯降低（圖3A）。隨后，本研究對于不同階段的結直腸患者組織進行分析，本研究發現在結直腸癌的第一階段，FOXO3a表達相對于健康人明顯降低（圖3B），同時，本研究還對不同性別的患者進行了檢測，本研究發現，FOXO3a在男性患者中降低的更為明顯（圖3C）。為了進一步確認，FOXO3a在結直腸癌中的作用，本研究采用免疫組化方法檢測結直腸癌患者中癌-癌旁中的表達，結果顯示在結直腸患者中FOXO3a表達相對于癌旁組織表達明顯降低。

圖2 mir-1236通過靶向FOXO3a基因調節HCT116細胞增殖。2A：TargetScan軟件預測，FOXO3a基因與mir-1236潛在種子序列；2B：熒光素酶報告分析；2C、2D：分別轉染mir-1236-mimic或mir-1236 inhibitor后FOXO3a的蛋白和mRNA表達。*與對照組相比P＜0.05

討 論

在臨床上，40～50歲年齡組的CRC發生率較高。男性發病率是女性的2～3倍。隨著我國人民生活水平的提高和飲食結構的變化，CRC的發病率呈逐年上升的年輕化趨勢，嚴重威脅著人們的健康和生活質量［12］。CRC早期癥狀不明顯，容易漏診。患者多為晚期，治療難度大，療效差，預后差。因此如何診斷預防以及治療結直腸癌成為廣大醫學工作者需要解決的問題。

FOXO是一類進化上高度保守的轉錄因子，廣泛參與許多生物過程的調控，如胚胎發育、細胞增殖、細胞周期和凋亡。FOXO轉錄因子家族共有4個成員，分別是FOXO1、FOXO3a、FOXO4和FOXO6，其中FOXO3是研究最多的核心成員［6-7］。在本研究的結果中發現CRC時FOXO3a表達異常降低，提示其可能具有抑癌作用［8-9］。

同時miR-1236參與多種癌癥的生理過程，可通過抑制HDAC3和SENP1表達來調控缺氧誘導的宮頸癌的侵襲和轉移［13］，還可以靶向激活p21WAF1/CIP1，抑制腎細胞癌增殖［14］。然而本研究的結果顯示miR-1236能夠對于結直腸癌細胞活性產生影響，本研究發現過表達miR-1236后能夠促進HCT116細胞活性增加，而低表達miR-1236后不僅僅能影響細胞活性，還能使其增殖能力相對于NC對照組明顯減弱（圖1D～1F），提示本研究miR-1236參與了結直腸癌的病理生理過程（圖1）。本研究的結果與Li等［11］人的研究相似，他們報道了，miR-1236能夠通過ceRNA方式抑制肝細胞癌的增殖。而后，為了進一步確定miR-1236是如何發揮其作用的，本研究通過生物信息學網站查詢了相應的結合位點，發現FOXO3a與miR-1236有相應的結合位點。通過luciferase實驗，確定了FOXO3a為miR-1236的靶基因（圖2），同時，檢測了過表達miR-1236后FOXO3a蛋白以及mRNA水平的變化，結果顯示，過表達miR1236能夠明顯抑制FOXO3a的表達，而低表達miR-1236能夠增加FOXO3a的表達。以上的結果提示：結直腸癌細胞系HCT116中，miR-1236通過抑制FOXO3a的表達從而發揮促癌作用，同時，通過TCGA以及免疫組化的方法證明了，FOXO3a在結直腸癌中低表達（圖3），而本研究的結果也符合miRNA靶向靶基因的經典作用機制。

總之，本研究結果首次證明了miR-1236對于結直腸癌增殖能力的作用，而miR-1236的作用是直接調控FOXO3a基因進而實現的，同時FOXO3a在結直腸癌中是一個抑癌因子。本研究的結果為miR-1236可能成為結直腸癌患者的一種潛在治療藥物或者靶點提供了有力證據。

圖3 FOXO3a在結直腸癌中的表達。3A：TCGA數據庫檢測FOXO3a在癌癥-癌旁中的表達；3B：TCGA數據庫檢測FOXO3a在不同腫瘤階段中的表達；3C：TCGA數據庫檢測FOXO3a與不同性別的表達；3D：免疫組化檢測FOXO3a在男性患者中結直腸癌組織中的表達