杜慧穎,趙 爽,李美娜,馬 堃,李婷婷

(大連民族大學生命科學學院,遼寧大連 116600)

鯉魚(Cyprinuscarpio)又名鯉拐子、鯉子、毛子,紅魚等,為鯉科鯉屬食草性淡水魚類。其多棲息于江河、湖泊、水庫、池沼中水草叢生的水體底層,是我國淡水漁業(yè)中的重要養(yǎng)殖品種[1]。鯉魚營養(yǎng)價值豐富,魚肉中含有大量氨基酸平衡的優(yōu)質蛋白,其脂肪多為人體必需的多不飽和脂肪酸,還含有鉀、鈣等微量元素,肉質鮮美,因而深受消費者喜愛[2-4]。但由于其組織柔嫩、體內(nèi)組織酶類活性強,極易發(fā)生腐敗變質,因此開展鯉魚保鮮研究意義重大。

魚鱗中的蛋白質含量高達70%,主要包括膠原蛋白和魚鱗硬蛋白。魚鱗膠原蛋白中含有豐富的甘氨酸和脯氨酸,水解產(chǎn)物中含有大量的生理活性肽,在保健和美容方面應用前景廣闊。魚鱗硬蛋白中含有大量的疏水性氨基酸,其經(jīng)酶解后,含疏水氨基酸的肽釋放,并參與到酶解產(chǎn)物的抗氧化過程中,使其具有較強的抗氧化作用[5-6]。這些肽分子量小、水溶性好、易吸收,其生理特性在食品和醫(yī)療等方面具有極大的應用價值,同時也能實現(xiàn)資源再利用,并減少環(huán)境污染。

天然抗氧化劑是指能改善食品品質和色、香、味以及為防腐和加工工藝的需求而加入的從天然食材中提取得到的物質,相比其他抗氧化劑,其本身及分解產(chǎn)物均無毒無害、穩(wěn)定性好、使用方便且價格便宜[7]。蔣妍等[8]研究的草魚魚鱗酶解液對鰱魚魚丸貯藏及品質特性的影響實驗,李凱風等[9]將草魚魚鱗酶解液作為基料的涂膜劑實驗,均證實魚鱗酶解液在食品保鮮方面有巨大的開發(fā)及應用潛能。本文以新鮮鯉魚肉為實驗對象,將其分別浸漬在不同濃度的鯉魚魚鱗蛋白酶解液中,通過相關指標測定,綜合評價蛋白酶解液對鯉魚肉冷藏期間品質變化的影響,為鯉魚魚鱗蛋白酶解液在水產(chǎn)品保鮮及相關領域中的應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮鯉魚 購于大連開發(fā)區(qū)沃爾瑪超市,活體運至實驗室,每條魚的體長為(35±5) cm質量為(1200±50) g;堿性蛋白酶(1∶200000) 北京索萊寶科技有限公司;1,1-二苯基-2-苦肼基自由基 梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司;濃鹽酸、氫氧化鈉、三氯甲烷、95%乙醇及乙醇 大連凱美化工有限公司;乙二胺四乙酸二鈉 北京化工廠。

SHZ-D(Ⅲ)高速分散均質機 上海昂尼儀器儀表有限公司;UV-2100型紫外可見分光光度計 尤尼柯上海儀器有限公司;冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司; BR4i臺式高速冷凍離心機 法國Jouan;T-25勻漿機 德國IKA;Lambda 25紫外可見分光光度計 美國Perkin Elmer。

1.2 實驗方法

1.2.1 鯉魚魚鱗蛋白酶解液制備 參考馮建慧等[10]法并稍作修改。整個提取操作均在4 ℃下進行,將剪碎的鯉魚魚鱗以1∶30 (g/mL)比例浸入1.0 mol/L HCl溶液中攪拌2 h,期間更換新鮮的HCl溶液1次,結束后用超純水清洗至中性,烘干;然后將清洗后的魚鱗以1∶15 (g/mL)比例浸入0.2 mol/L NaOH溶液中攪拌24 h,除去魚鱗中的雜蛋白,期間不斷更換新鮮的NaOH溶液,結束后用超純水清洗至中性;按底物濃度15.2%的比例加入超純水,100 ℃水浴加熱2 min,調節(jié)體系pH為10.0,在水浴鍋預熱30 min后按比例加入4980 U/g堿性蛋白酶,51.2 ℃下水浴酶解5.1 h后,100 ℃水浴加熱滅酶10 min,用3層紗布過濾,濾液10000×g離心15 min取上清液,冷凍干燥成粉,用超純水配置成不同濃度的鯉魚魚鱗蛋白酶解液。

1.2.2 鯉魚樣品處理 將鯉魚去頭,去尾,去皮,取背部魚肉切成長2 cm、寬1.5 cm、厚15 mm的魚肉塊,以無菌水浸漬處理的鯉魚魚肉為空白組,以不同濃度鯉魚魚鱗蛋白酶解液(0.01、0.03、0.04 g/mL)浸漬處理的鯉魚魚肉為處理組,采用普通蒸煮袋包裝于4 ℃貯藏。

1.2.3 DPPH自由基清除率的測定 用95%乙醇配制濃度為0.1 mmol/L的DPPH溶液,避光保存。取2.5 mL DPPH溶液與等體積的不同濃度鯉魚魚鱗蛋白酶解液混勻(0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10 g/mL),暗室常溫靜置30 min,在517 nm下以2.5 mL的超純水和等體積的95%乙醇混合液為對照,測吸光度,由公式1計算DPPH自由基清除率。

式(1)

式中:AC為2.5 mL DPPH溶液+2.5 mL超純水吸光度;Ai為2.5 mL DPPH溶液+2.5 mL樣品液吸光度;Aj為2.5 mL樣品液+2.5 mL 95%乙醇吸光度。

1.2.4 細菌總數(shù)測定 菌落總數(shù)的測定根據(jù)GB 4789.2-2016[11]中檢測方法進行菌落總數(shù)的測定。使用平板計數(shù)法,采用平板傾注法計數(shù)測定。

1.2.5 可溶性蛋白含量的測定 參考李學英等[12]的方法并稍作修改。在0.5 g對照組及處理組鯉魚肉中添加10 mL 50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(含0.6 M KCl,pH7.4)高速勻漿1 min,勻漿液5 ℃下10000×g離心8 min,取上清液用0.6 mol/L KCl溶液稀釋10倍,使用雙縮脲法測定其蛋白質濃度。

1.2.6 蒸煮損失率的測定 參考蔣妍等[8]的方法并稍作修改。將5 g魚肉(M1)用真空封口機封口后放入100 ℃沸水中10 min,取出后放入底部墊有紗布的離心管中,在4000×g,4 ℃下離心10 min后記重(M2),由公式2計算其蒸煮損失率。

式(2)

1.2.7 汁液流失率測定 參考李學英等[12]的方法并稍作修改。準確稱取5 g魚肉置于底部墊有紗布的離心管中,4000×g,4 ℃離心10 min后記重,汁液流失率由公式3計算:

式(3)

式中:w(m,B)為離心前肉塊質量(g);w(m,A)為離心后肉塊質量(g)。

1.2.8 TBA測定 參考Siu等[13]的方法并稍作修改。稱取10 g碎魚肉與25 mL超純水混勻勻漿后,加入25 mL 5% TCA溶液,靜置30 min后過濾,所得濾液用5% TCA定容至50 mL。取5 mL 0.02 mol/L TBA溶液加入含5.00 mL上述所得濾液的具塞試管中,并于80 ℃恒溫水浴40 min,冷卻至室溫后,測定其在532 nm處的吸光值A。TBA值用丙二醇(MDA)的質量分數(shù)表示,單位為mg/kg樣品。

1.2.9 酸價測定 參考李婷婷等[14]的方法并稍作修改。準確稱取5.00 g樣品與15 mL三氯甲烷-甲醇(體積比2∶1)混合,渦旋振蕩2 min后超聲提取15 min,以4500 r/min 離心6 min,取上清液使用。

稱取3.0～5.0 g所提油樣,與50 mL體積比2∶1的中性乙醚-乙醇溶液混勻,以酚酞為指示液,用氫氧化鉀標準滴定液(0.050 mol/L)滴定至初現(xiàn)微紅色,且0.5 min內(nèi)不褪色,記錄數(shù)據(jù),由公4計算其酸價值。

式(4)

式中:Vk為消耗氫氧化鉀標準滴定液體積(mL);Ck為氫氧化鉀標準滴定的實際濃度(mol/L);m樣為樣品質量(g)。

1.2.10 肌原纖維蛋白游離巰基與總巰基含量的測定 參考Youngsawatdigul[15]的方法并加以修改。將魚肉樣品經(jīng)組織粉碎后加入5倍體積的10 mmol/L Tris-HCl(pH7.2)緩沖液中,高速均質3次,每次30 s,在5000×g,4 ℃條件下離心10 min,取沉淀按上述過程反復3次,在最后一次沉淀中加入5倍體積的10 mmol/L Tris-HCl緩沖液(含0.6 mol/L NaCl,pH7.2),高速均質,在4500×g,4 ℃條件下離心10 min,取上清液為肌原纖維蛋白液,采用雙縮脲法測定蛋白質濃度。

取5 mg/mL蛋白溶液1 mL于試管中并添加9 mL磷酸鹽緩沖液(含0.6 mol/L KCl,10 mmol/L EDTA,8 mol/L尿素,濃度為50 mmol/L,pH=7.0)。取5 mL上述混合液加入0.5 mL 0.1% 2-硝基苯甲酸,25 ℃保溫25 min,波長為412 nm測吸光度即為總巰基的吸光度。游離巰基含量是在不含尿素的條件下4 ℃反應l h,由公式5算蛋白質總巰基含量。

蛋白質總巰基含量(nmol/mg)=(A×V磷酸鹽×109)/(ε×b×V蛋白質×C蛋白質)

式(5)

式中:A為吸光值;V磷酸鹽為磷酸鹽緩沖液(L)為0.005 L;ε為13600 L/(mol·cm);b為光程為1 cm;V蛋白質為取樣蛋白質(mL);C蛋白質為取樣蛋白質的濃度(mg/mL)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Orgin 2018繪圖并用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行分析,p<0.01為差異極顯著,p<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 DPPH自由基清除率測定結果

魚肉中含有大量的蛋白質和脂類物質,極易在加工和貯藏過程中發(fā)生蛋白質氧化和脂質氧化[16]。DPPH自由基是體外抗氧化實驗中最常用的對象。DPPH法操作簡單,結果穩(wěn)定,重現(xiàn)性好,因此,可以采用自由基被清除的程度來評價一種物質的抗氧化能力,當自由基清除率越大,對應的該物質抗氧化能力越強[17]。圖1為不同濃度的鯉魚魚鱗蛋白酶解液的DPPH自由基清除率,當鯉魚魚鱗蛋白酶解液濃度小于0.03 g/mL時,DPPH自由基清除率能力隨濃度的增加大幅度增加,原因可能是隨著濃度的的增加,有抗氧化能力的多肽含量也相對增加,進而擁有較高DPPH自由基清除能力。但當鯉魚魚鱗蛋白酶解液濃度大于0.03 g/mL時,DPPH自由基清除率呈先減小后小幅度增加趨勢,可能是蛋白酶解液中的多肽與DPPH自由基結合達到飽和,有抗氧化能力的多肽比例下降,DPPH自由基清除能力下降。為證明鯉魚魚鱗蛋白酶解液抗氧化能力與濃度有關且與無菌水浸漬處理的對照組鯉魚魚肉相比有顯著效果,因此,選取DPPH自由基清除能力很強的0.03和0.04 g/mL以及DPPH自由基清除能力最弱的0.01 g/mL鯉魚魚鱗蛋白酶解液作為實驗組。

圖1 不同濃度鯉魚魚鱗蛋白酶解液的DPPH自由基清除率

2.2 菌落總數(shù)測定結果

由圖2可知,不同處理組鯉魚魚肉的的細菌總數(shù)隨保藏時間的延長而增加。各組初期增加緩慢,空白組在第4 d迅速增加,而處理組在第6 d后才顯著上升。這是由于內(nèi)源性酶的降解使魚肉體內(nèi)的細菌處于抑制或生長緩慢的狀況,而在保藏后期,魚肉體內(nèi)細菌進入對數(shù)生長期,代謝作用快速,細菌總數(shù)持續(xù)上升。參考蔣妍等[8]測定標準,一級鮮度≤4.01lg CFU/g,二級鮮度為4.01～6.01lg CFU/g,變質肉≥6.01lg CFU/g。如圖2所示空白組的魚肉在第6 d開始發(fā)生變質,而處理組在第6 d后細菌總數(shù)的增長趨勢相對平緩,直到保藏結束仍處于二級鮮度。其中濃度為0.03 g/mL的處理組的細菌總數(shù)變化最緩慢,在8～10 d菌落總數(shù)才才明顯增加。鯉魚魚鱗蛋白酶解液中具有抗氧化功能的多肽,這類抗氧化多肽具有一定的抑菌性,而且抗氧化能力越高其抑菌效果越好,因此0.03 g/mL鯉魚魚鱗蛋白酶解液具有較好的抑制鯉魚魚肉細菌增長的效果,0.04和0.01 g/mL次之。

圖2 保藏過程中不同處理組鯉魚魚肉細菌總數(shù)變化

2.3 可溶性蛋白含量測定結果

如圖3所示,4 ℃冷藏期間,處理組和空白組的蛋白質溶解度持續(xù)下降,空白組的蛋白質溶解度低于處理組的蛋白質溶解度且下降趨勢較快,這可能是由于豐富的氧離子促進了蛋白質氧化,而蛋白質氧化聚集導致鯉魚肌肉蛋白結構變化從而導致其品質的變化[18]。其中濃度為0.03 g/mL具有最強抗氧化性鯉魚魚鱗蛋白酶解液的蛋白溶解度下降最慢。因此,鯉魚魚鱗蛋白酶解液可抑制魚肉蛋白氧化,減緩魚肉的變質。

圖3 保藏過程中不同處理組鯉魚魚肉的溶解度變化

2.4 蒸煮損失率測定結果

水分蒸煮損失率反映了蒸煮過程中肉制品中的水分流失[19]。由圖4可知,不同處理組鯉魚魚肉的蒸煮損失率隨著保藏時間延長逐漸增加,可能由于冷藏期間魚肉蛋白降解系水能力減弱或者微生物分解魚體肌肉,從而增加水分流失[9]。其中濃度為0.03 g/mL具有最強抗氧化性鯉魚魚鱗蛋白酶解液的蒸煮損失率最低,0.04 g/mL次之,空白組最高,說明鯉魚魚鱗蛋白酶解液具有一定的保留魚肉水分的能力。

圖4 保藏過程中不同處理組鯉魚魚肉的蒸煮損失率變化

2.5 汁液流失率測定結果

從圖5可知,不同處理組鯉魚魚肉的汁液流失率隨著保藏時間延長逐漸增加,空白組的鯉魚魚肉汁液流失率高于處理組,這可能是由于蛋白質氧化和變性,削弱了肌肉組織保留水的能力,從而導致汁液流失率較高[12]。此外,在冷藏期間的0～6 d空白組的汁液流失率的變化顯著高于處理組的鯉魚魚肉變化(p<0.05),其中濃度為0.03 g/mL處理組汁液損失率增長最緩慢。結果表明,鯉魚魚鱗膠原蛋白酶解液可延緩組織中的蛋白質變性,增強魚肉的保水能力,延長魚肉的保鮮期。

圖5 保藏過程中不同處理組鯉魚魚肉的汁液流失率變化

2.6 TBA測定結果

TBA值用于測定食品中脂質的氧化酸敗程度,特別是肉類和水產(chǎn)品中脂肪的氧化酸敗程度。當TBA值達到2.00 mg/kg時,魚肉會產(chǎn)生令人厭惡的味道[20]。是由于貯藏時間的延長,脂肪酸(特別是不飽和脂肪酸)的自動氧化增加了鯉魚魚肉脂肪氧化酸敗的程度,產(chǎn)生無色無味的脂質氫過氧化物,進一步降解形成醛、酮、醇和其他具有特殊氣味的小分子[21-22]。從圖6可知,不同處理組鯉魚魚肉的TBA值隨保藏時間的增加而增大,可能是隨著貯藏期延長引起氧化加劇,導致乳化體系中脂肪球周圍的蛋白膜降解[23-24]。新鮮鯉魚初始TBA值為0.26 mg/kg,略低于李凱風等[9]鯽魚的0.28 mg/kg和李婷婷等[14]大黃魚的0.30 mg/kg。在第6 d時對照組的TBA值接近2.00 mg/kg,魚肉發(fā)生腐敗變質,濃度為0.01和0.04 g/mL的處理組在第10 d發(fā)生變質,而濃度為0.03 g/mL處理組的效果最佳,TBA值上升幅度最小,并且在第10 d時仍未發(fā)生腐敗變質。說明鯉魚魚鱗的蛋白酶解液能減緩脂肪氧化,抑制中間產(chǎn)物的降解,保持魚肉的新鮮度,使魚肉的保藏期延長4 d。

圖6 保藏過程中不同處理組鯉魚魚肉的TBA變化

2.7 酸價測定結果

酸價是測定肉類和脂肪中游離脂肪酸含量的指標。在動物油脂中,酸價越小代表著脂肪的新鮮度和質量越好。如圖7所示冷藏期間空白組和處理組的鯉魚魚肉酸價呈增加趨勢,空白組在6～10 d內(nèi)酸價增長迅速,而處理組的酸價增長平緩直到第10 d酸價仍低于空白組。濃度為0.03 g/mL的處理組酸價增加最慢,抑制效果最好。所以鯉魚魚鱗的蛋白酶解液有效抑制鯉魚肉質中的脂肪氧化,減緩脂肪酸敗,延長貨架期,保持肉質的新鮮品質。

圖7 保藏過程中不同處理組鯉魚魚肉的酸價變化

2.8 肌原纖維蛋白總巰基和游離巰基含量測定結果

巰基氧化會使蛋白質形成二硫鍵,進一步發(fā)展形成交聯(lián)網(wǎng)狀結構,影響肉的質構[25]。如圖8所示,在冷藏期間對照組的總巰基含量下降31%,這與Eymard等[26]發(fā)現(xiàn)金屬盒包裝的竹夾魚碎肉在貯藏期間總巰基含量顯著下降的結果一致,而濃度為0.03 g/mL的處理組總巰基含量僅下降20%,雖然不同處理組的鯉魚魚肉肌原纖維蛋白總巰基含量呈下降趨勢,但隨著保藏時間延長,處理組的肌原纖維蛋白顯示了更好的穩(wěn)定性,其總巰基含量下降趨勢平緩于空白組。

圖8 保藏過程中不同處理組鯉魚魚肉的總巰基含量變化

如圖9所示,對照組和處理組的游離巰基含量呈先增加后下降趨勢。冷藏初期空白組游離巰基上升速度最快,在第6 d達到最高值。冷藏后期,空白組游離巰基含量下降速度迅速,游離巰基含量也由降到最低。這是蛋白質變性導致蛋白質結構變化使得巰基外露,巰基含量增加,而蛋白質氧化導致的活性巰基降低也對巰基有一定的消耗[26-27],說明具有一定的抗氧化性鯉魚魚鱗蛋白酶解液能夠減緩蛋白質氧化,對于魚肉肌原纖維蛋白中的游離巰基具有一定的穩(wěn)定性。

圖9 保藏過程中不同處理組鯉魚魚肉的游離巰基含量變化

3 結論

通過對不同濃度鯉魚魚鱗蛋白酶解液(0.01、0.03、0.04 g/mL)和對照組的菌落總數(shù)、可溶性蛋白含量、蒸煮損失率、汁液流失率、TBA值、酸價、總巰基與游離巰基含量等指標對比,說明具有一定的抗氧化能力的鯉魚魚鱗的蛋白酶解液,可以有效抑制鯉魚肉細菌增長、肉質氧化,延緩脂肪酸敗,同時保持魚肉的新鮮度。同時0.03 g/mL鯉魚魚鱗蛋白酶解液的處理效果最佳,使鯉魚魚肉的保藏期延長4 d。綜上所述,鯉魚魚鱗蛋白酶解液的應用不僅促進了水產(chǎn)廢棄物的資源利用,減少了環(huán)境危害,還為水產(chǎn)保鮮劑的開發(fā)奠定了一定的基礎。