五味子多糖對對乙酰氨基酚誘導的小鼠肝細胞凋亡的影響

車金營,楊 碩,喬子敬,楊雪晗,李 賀,孫靖輝,陳建光,王春梅

(北華大學藥學院,藥理教研室，吉林吉林 132013)

藥物性肝損傷(Drug-induced liver injury,DILI)通常指肝臟受藥物及其代謝產物毒性損傷或超敏反應引起的疾病,是當前急性肝損傷最為常見的病因之一,嚴重者可導致急性肝衰竭甚至死亡[1]。最新的研究表明,每年DILI在我國普通人群中的發病率至少為23.80/10萬人,占藥物不良反應的10%左右,因此防治DILI對降低臨床肝病的發生率具有重要意義[2]。對乙酰氨基酚(Acetaminophen,APAP)是臨床常用的解熱鎮痛藥,過量攝入可使肝細胞中產生大量的代謝產物——N-乙酸-對苯醌亞胺,耗竭谷胱甘肽(Glutathione,GSH),引起氧化應激及線粒體損傷,致使肝細胞發生凋亡及壞死,是建立急性DILI模型常用的工具藥,也是引起急性DILI的最常見原因之一[3]。

五味子(Schisandrachinensis(Turcz)Baill)為我國傳統保肝藥物。有研究表明五味子發揮護肝作用的主要成分是其脂溶性成分木脂素類[4]，但中醫藥的傳統使用方法為水煎,提示其水溶性成分是具有藥理活性的。近年來五味子多糖(Schisandrachinensispolysaccharide,SCP)的降酶護肝、促進肝臟再生等作用研究越來越受到關注[5]。課題組的前期研究已證實SCP對酒精、CCl4、高脂飲食等誘導的肝損傷都有一定的保護作用,且具有顯著的抗氧化活性[6-10]。目前,SCP對APAP致急性DILI保護作用的研究鮮有報道、其作用機制也尚不明確。

因此,本實驗采用一次性腹腔注射APAP誘導的小鼠急性嚴重肝損傷模型,進一步觀察SCP對急性藥物性肝損傷的保護作用,同時探討SCP是否通過抑制APAP誘導的肝細胞凋亡而發揮保護肝損傷作用,以期為今后五味子的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

五味子 吉林省集安五味子種植基地;氨基磺酸、間羥基聯苯 美國Sigma公司;葡萄糖、無水乙醇 北京市化學試劑公司;苯酚、濃硫酸 國藥化學試劑集團,分析純;對乙酰氨基酚(批號A105808-25g) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;雄性ICR 小鼠50只,體重19～22 g,長春伊斯實驗動物技術有限公司(合格證號:SCXK(吉)2016-0004);丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、丙二醛(MDA)、天冬氨酸轉氨酶(AST)蘇木精和伊紅(HE)染色試劑盒、谷胱甘肽(GSH) 南京建成生物工程研究所;Hoechst 33258染色、ECL顯影液及BCA蛋白定量試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司;HCL-Tris、30%丙烯酰胺、TEMED、過硫酸銨及甘氨酸 北京鼎國試劑公司;脫脂奶粉 美國BD公司;p-JNK、JNK、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、Caspase-3抗體 武漢ABclonal公司。

Shimadzu HPLC系統(LC-10ATvp泵和SPD-10AVD紫外光檢測器)、Thermo ODS HYPERSIL高效液相色譜柱 日本島津公司;Infinite M200酶標儀 瑞士Tecan集團;Western blot電泳儀、電轉儀 美國Bio-Red 公司;Nikon Eclipse Ti-SR倒置熒光顯微鏡 日本Nikon公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 五味子多糖制備 稱取五味子干燥果實1.5 kg,加入10倍量蒸餾水浸泡24 h,煮沸2次(3+2 h),合并提取液并以80 ℃濃縮至2 L,將濃縮液離心(4500 r/min,15 min),棄去沉淀。向上清液中加入95%乙醇,使乙醇終濃度為75%(用酒精計測定),沉淀24 h,離心(4500 r/min,15 min),收集沉淀。將沉淀依次用95%乙醇和無水乙醇洗滌,水浴蒸干,得粉末狀SCP[6]。按照式(1)計算SCP得率。

SCP得率(%)=SCP質量(g)×100/五味子質量(g)

式(1)

1.2.2 五味子多糖化學組成分析 配制0.01 mg/mL葡萄糖溶液繪制標準曲線,采用苯酚-硫酸法測定糖含量[11];應用間羥基聯苯法測定SCP中糖醛酸的含量[12];考馬斯亮藍法測定蛋白含量[13];1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化和高效液相色譜法(HPLC)進行單糖組分分析[14]。HPLC法采用Shimadzu HPLC系統(LC-10ATvp泵和SPD-10AVD紫外檢測器),DIKMA Inertsil ODS-3 色譜柱(4.6×150 mm),流動相為0.1 mol/L的PBS,pH7.0-乙腈82∶18 (v/v),流速1.0 mL/min,35 ℃檢測,進樣量20 μL,檢測波長為245 nm。

1.2.3 APAP誘導小鼠急性肝損傷模型的建立及分組 將雄性ICR小鼠50只,分為5組,分為對照組(CON)、肝損傷模型組(MOD)和25、50、100 mg/kg SCP組,每組10只。SCP各給藥組給予相應劑量的SCP,CON組及MOD組給予同體積的生理鹽水,連續灌胃2周,每天一次。末次給藥后1 h,MOD組及SCP各給藥組小鼠一次性腹腔注射APAP(250 mg/kg),CON組以相同方式給予生理鹽水[15]。所有小鼠均禁食不禁水。24 h后眼球取血,3500 r/min,4 ℃離心5 min,分裝血清。將小鼠斷髓處死,小心取出肝臟,生理鹽水清洗后濾紙吸干水分,觀察肝臟整體形態,稱量并按照式(2)計算肝指數:隨后將肝組織一部分用福爾馬林固定,另一部分保存于-80 ℃冰箱中。

肝指數(mg/g)=肝質量(mg)/體質量(g)

式(2)

1.2.4 小鼠血清中ALT、AST及肝組織中GSH、MDA水平檢測 采用酶法檢測小鼠血清中ALT及AST水平;另取肝組織100 mg,加入9倍量的生理鹽水于冰水浴中制成10%組織勻漿,3500 r/min離心10 min,取上清液,采用二硫代對硝基苯法和硫代巴比妥法試劑盒測定GSH及MDA水平[6]。所有檢測方法均依據南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書進行測定。

1.2.5 HE染色 取福爾馬林固定的肝組織,經石蠟包埋、切片,進行蘇木精-伊紅(HE)染色,觀察肝細胞病理形態變化[9]。

1.2.6 Hoechst 33258染色 將5 μmol/L的石蠟切片脫蠟水化后,根據Hoechst 33258染色試劑盒的說明進行染色,并在倒置熒光顯微鏡下觀察染色的細胞核[15]。在顯微鏡高倍視野下隨機選取3個區域,以計算陽性肝細胞數及肝細胞總數。根據式(3)計算。

肝細胞凋亡率(%)=陽性肝細胞數×100/肝細胞總數

式(3)

1.2.7 Western blot 法檢測凋亡相關蛋白表達水平 將凍存的肝組織取出,加入裂解液,冰上裂解1 h,離心(4 ℃、12000 r/min、10 min)收集上清液。采用BCA法測定樣本蛋白濃度,在10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離目標蛋白,電轉移至PVDF膜2 h,隨后用封閉液(含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液)封閉1 h。室溫孵育后棄去封閉液,加入p-JNK、JNK、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、Caspase-3第一抗體(1∶1000)4 ℃過夜[10]。次日用TBST緩沖液洗滌3×10 min,并與第二抗體(1∶5000)室溫下孵育1 h,TBST緩沖液洗滌3×10 min,最后加入ECL顯影液,并在化學發光儀器上觀察條帶并通過圖像分析分析結果。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 五味子多糖化學組成分析

本研究采用經典的水提醇沉法制備五味子多糖[7],由表1可知,SCP得率為8.55%,糖含量為40.60%,糖醛酸含量為24.70%,蛋白質含量為1.51%。從單糖組成分析結果顯示SCP中葡萄糖和半乳糖醛酸的含量較高,分別占38.00%及36.70%,其次是半乳糖、阿拉伯糖及鼠李糖,分別占12.00%、7.30%、4.00%,同時還含有少量的甘露糖,約占1.20%。

表1 五味子多糖的化學組成分析(%)

2.2 各組小鼠肝質量及肝指數

肝指數的變化通常能夠反映肝組織是否腫大、萎縮,也是反映肝組織損傷程度的指標之一[16]。由表2可知,與CON組相比,MOD組小鼠肝質量和肝指數顯著升高(p<0.05),說明一次性腹腔注射250 mg/kg APAP可引起肝組織水腫,肝損傷造模成功。而與MOD組相比,50及100 mg/kg SCP組小鼠的肝質量及肝指數均顯著下降(p<0.05),而25 mg/kg SCP組下降不顯著(p>0.05)表明適當劑量的SCP能夠減輕APAP引起的肝組織水腫,保護肝損傷。

表2 各組小鼠肝質量及肝指數(n=10)

2.3 各組小鼠血清中ALT、AST及肝組織中GSH、MDA水平

肝臟是藥物在體內代謝的主要場所,最容易受到藥物的影響[17]。當肝細胞受損時,細胞內的ALT和AST被大量釋放到血液中,使血液中酶活性顯著增加。因此,血清中ALT和AST水平被認為是反映肝臟受損的敏感指標[18]。由表3可知,與CON組相比,MOD組小鼠血清中ALT、AST水平極顯著升高(p<0.01),表明一次性大劑量注射APAP可使小鼠肝細胞損傷。而與MOD組相比,25及50 mg/kg SCP組小鼠血清中ALT、AST水平顯著降低(p<0.05),100 mg/kg SCP組小鼠血清中ALT、AST水平極顯著降低(p<0.01),表明SCP對APAP誘導的急性肝細胞損傷具有一定的保護作用。

相關研究表明:過量的APAP經肝臟CYP450酶代謝產生大量的代謝產物,致使肝細胞內GSH快速消耗,產生氧化應激進而引起肝細胞損傷[19]。由表3可知,與CON組相比,MOD組小鼠肝組織中GSH水平顯著下降(p<0.05),MDA水平顯著升高(p<0.05),表明小鼠機體的抗氧化能力顯著下降。而與MOD組相比,50 及100 mg/kg SCP組肝組織中GSH水平顯著升高、MDA水平顯著降低(p<0.05),表明SCP可以通過提高機體抗氧化能力改善APAP誘導的小鼠急性肝損傷。

表3 各組小鼠血清中ALT、AST及肝組織中GSH、MDA水平(n=10)

2.4 各組小鼠肝臟形態及組織病理學

由圖1可知,觀察小鼠解剖后的肝臟,CON組小鼠肝臟顏色為紅褐色,表面光滑。MOD組小鼠肝體積增大,局部點狀區域呈土黃色,顯示肝組織部分壞死。組織病理學顯示:CON組小鼠肝小葉結構完整,肝細胞形態正常,肝索排列規則。MOD組小鼠肝小葉結構紊亂,中央靜脈附近出現炎性浸潤及部分變性壞死,肝細胞胞漿疏松化。表明APAP誘導小鼠急性肝損傷模型建立成功。

圖1 各組小鼠肝臟病理學形態比較

與MOD組相比,SCP各給藥組小鼠解剖后的肝臟顏色及組織壞死程度介于MOD組與CON組之間,均有不同程度的變化。組織病理學顯示SCP各給藥組小鼠肝索排列趨于整齊、肝細胞形態明顯好轉,中央靜脈附近的炎性浸潤及變性壞死較MOD組明顯減少。表明SCP可改善APAP誘導小鼠肝組織病理學變化。

2.5 各組小鼠肝細胞凋亡現象

為了進一步探討SCP是否抑制APAP誘導的肝細胞凋亡,采用Hoechst 33258染色觀察了肝細胞的凋亡情況。結果由圖2a可知,CON組肝細胞排列整齊,規則,形態良好,幾乎沒有亮藍色濃染的細胞,MOD組的中央靜脈的肝細胞核呈現出明亮的致密性濃染,細胞核固縮,表明過量的APAP可以使小鼠肝細胞凋亡增加。SCP各給藥組肝細胞內亮藍色濃染均不同程度減輕,且程度介于MOD組及CON組之間。CON組、MOD組、25、50及100 mg/kg SCP組的肝細胞凋亡率依次為16.56%、57.83%、39.45%、32.29%和23.71%。由圖2b可知,與CON組相比,MOD組細胞凋亡率極顯著增加(p<0.01);而與MOD組相比,25 和50 mg/kg SCP組細胞凋亡率顯著降低(p<0.05),100 mg/kg SCP組肝細胞凋亡率極顯著降低(p<0.01)。這些結果表明SCP對APAP誘導肝損傷的保護作用可能是通過抑制細胞凋亡實現的。

圖2 各組小鼠肝組織細胞凋亡情況(a)及肝細胞凋亡率(b)(100×)

2.6 Western blot 法檢測小鼠凋亡蛋白表達水平

Baek[20]等研究發現,APAP介導細胞凋亡的Caspase通路是其造成急性肝損傷的必要途徑。為了探討SCP抑制APAP誘導肝細胞凋亡的機制,進一步檢測肝組織中Cleaved caspase-3、促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達情況。由圖3可知,與CON組相比,MOD組Bax、Cleaved caspase-3蛋白表達水平極顯著升高(p<0.01),且Bcl-2的表達水平極顯著降低(p<0.01),表明過量的APAP可激活凋亡通路相關蛋白,促進細胞凋亡。而與MOD組相比,25和50 mg/kg SCP組Bax蛋白表達顯著降低(p<0.05),100 mg/kg SCP組Bax蛋白表達極顯著降低(p<0.01),SCP各組Cleaved caspase-3表達極顯著降低,Bcl-2表達極顯著升高(p<0.01)。表明SCP可顯著抑制APAP誘導的凋亡蛋白Bax、Cleaved caspase-3表達量的增加以及Bcl-2表達的降低。同時,有研究表明在過量APAP造成肝損傷的過程中,JNK被磷酸化激活并進入線粒體是關鍵步驟[21],而JNK磷酸化后能夠影響Bcl-2家族相關蛋白表達,Bcl-2會阻止細胞色素C從線粒體釋放到細胞質,抑制Caspase家族的級聯反應[22]。結果由圖3B可知,與CON組相比,MOD組p-JNK表達水平極顯著增加(p<0.01);表明過量的APAP會激活JNK,使其磷酸化增加。與MOD相比,50及100 mg/kg SCP組p-JNK蛋白表達水平顯著降低(p<0.05),25 mg/kg SCP組p-JNK蛋白表達水平降低不顯著(p<0.05)。這些結果表明SCP可能通過阻斷JNK的磷酸化,進而抑制APAP引起的細胞凋亡。

圖3 各組小鼠肝組織p-JNK、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3蛋白表達情況

3 結論

本研究采用一次性給予小鼠APAP(250 mg/kg)建立急性肝損傷模型,觀察SCP對APAP誘導小鼠肝損傷的保護作用及對肝細胞凋亡的影響。結果顯示:SCP可明顯降低小鼠肝臟指數,血清轉氨酶水平,改善肝臟病理變化,對APAP誘導的DILI具有顯著的保護作用。SCP能顯著減少MDA含量、緩解GSH的消耗,提高了機體的抗氧化能力。進一步研究發現SCP能顯著降低肝組織中Cleaved caspase-3、Bax及升高Bcl-2的蛋白表達,說明SCP對APAP誘導的細胞凋亡具有抑制作用,其作用機制可能與抑制JNK信號通路的激活有關。本研究證實了SCP對APAP誘導的小鼠急性肝損傷具有一定的保護作用,這為五味子的深入研究及開發利用提供一定的理論基礎。