蘿種子生物堿提取工藝優化及其抑菌活性

孔 越,郭 斌,*,韓冠英,崔 鏨

(1.錦州醫科大學藥學院,遼寧錦州 121000;2.錦州醫科大學附屬第一醫院,遼寧錦州 121000)

蘿藦(Metaplexisjaponica)為蘿藦科蘿藦屬植物,多年生草質纏繞藤本,種子卵圓形,頂端有白色長絹毛,主要生長在我國東北、華北、華東等地。蘿藦中含有甾類、生物堿類、萜類、黃酮類、糖類和蛋白質等多種有效成份[1]。近年來,蘿藦由于其生物活性作用而備受關注,其揮發油和脂肪油均具有抗菌、抗氧化、抗炎等作用,具有較高藥用價值[2-4]。劉威等[5]將新鮮蘿藦小分子提取物應用于荷肝癌H22小鼠體內抗癌實驗,確定鮮蘿藦小分子提取物有明顯抗肝癌H22的作用。楊蕾[6]通過定性實驗,確定蘿藦藤中有生物堿類化合物。

提取生物堿的常見方法有微波輔助提取法、超臨界流體萃取法、超聲波輔助法、有機溶劑提取法等[7]。微波輔助提取法雖然提取效率高、溶劑使用量少[8],但是該技術只適用于熱穩定的物質[9]。超臨界萃取法萃取效率高,但對大分子和極性基團多的物質溶解性差,需加入夾帶劑,增加了能耗和污染,費力費時[10]。溶劑法成本低,操作簡單,根據生物堿的性質。溶劑法提取用的溶劑通常采用水、酸水-有機溶劑(常用0.5～1.0%的鹽酸、乙酸等為溶劑)、醇或堿化有機溶劑4種不同的溶劑[11]。目前已有很多種植物的生物堿提取工藝研究報道[12],但是卻未見對蘿藦種子生物堿提取工藝的報道。

本文采用酸水提取法,在單因素實驗的基礎上,通過正交設計優化蘿藦種子總生物堿提取工藝,并通過抑菌實驗初步研究蘿藦種子總生物堿對三種供試菌種的抑菌活性,為開發和利用蘿藦種子資源提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘿藦種子 采自于遼寧省錦州市周邊地區,經錦州市藥品檢驗所翟鐵紅主任藥師鑒定為蘿藦屬蘿藦種子;金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) 錦州醫科大學微生物實驗室提供;LB培養基 酵母提取物5 g,蛋白胨10 g、NaCl 10 g,加水至1000 mL,固體培養基加20 g瓊脂粉;氫氧化鈉、石油醚(沸點規格30～80 ℃)、二氯甲烷 天津永晟精細化工有限公司;其他試劑 均為國產分析純。

HH-4型電熱恒溫水浴鍋 上海騰方儀器有限公司;BP211D型電子分析天平 德國Sartorious公司;PHSJ-4A實驗室pH計 上海精密科學儀器有限公司;RE-3000旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;DHG-9245A型恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;SPX-150B生化培養箱 上海博泰實驗設備有限公司;LDZM立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;HR60-II-A2生物安全柜 青島海爾特種電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘿藦種子生物堿的提取方法 將蘿藦種子研磨成粉末,取粉碎后的粉末放入石油醚中浸泡過夜[13],蘿藦種子粉末:石油醚為1∶2 g/mL,抽濾,晾干,裝于密封袋放置干燥處以備用。

取脫脂后蘿藦種子粉末加入錐形瓶中,按一定比例加入濃度為0.1 mol/L的一定pH鹽酸水溶液,放入水浴鍋中,在一定溫度和時間的條件下進行提取,抽濾,收集濾液,將濾液旋轉蒸發濃縮,在濃縮液中加入適量的堿性水溶液調節pH至10～11,濃縮液出現渾濁沉淀,將濃縮液干燥即得蘿藦種子總生物堿。

1.2.2 蘿藦種子總生物堿得率的測定 用重量法[14]計算總生物堿得率。

1.2.3 蘿藦種子總生物堿的單因素實驗 以蘿藦種子總生物堿得率為指標,分別考察鹽酸水溶液pH、料液比、提取溫度、提取時間4個因素對蘿藦種子總生物堿得率的影響,每個因素設定5個水平,進行單因素實驗,每組實驗均重復三次,取平均值。

1.2.3.1 鹽酸水溶液pH對蘿藦種子總生物堿得率的影響 準確稱取10 g蘿藦種子粉末5份,放入5個錐形瓶中,采用1.2.1中提到的方法,在料液比1∶10 g/mL、提取溫度60 ℃、提取時間1.0 h的條件下,考察鹽酸水溶液pH(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0)對蘿藦種子總生物堿得率的影響。

1.2.3.2 料液比對蘿藦種子總生物堿得率的影響 準確稱取10 g蘿藦種子粉末5份,放入5個錐形瓶中,在鹽酸水溶液pH為2、提取溫度60 ℃、提取時間1.0 h的條件下,考察料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)對蘿藦種子總生物堿得率的影響。

1.2.3.3 提取溫度對蘿藦種子總生物堿得率的影響 準確稱取10 g蘿藦種子粉末5份,放入5個錐形瓶中,在鹽酸水溶液pH為2、料液比1∶20 g/mL、提取時間1.0 h的條件下,考察提取溫度(50、60、70、80、90 ℃)對蘿藦種子總生物堿得率的影響。

1.2.3.4 提取時間對蘿藦種子總生物堿得率的影響 準確稱取10 g蘿藦種子粉末5份,放入5個錐形瓶中,在提取液pH為2、料液比1∶20 g/mL、提取溫度80 ℃的條件下,考慮提取時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)對蘿藦種子總生物堿得率的影響。

1.2.4 蘿藦種子總生物堿的正交試驗 在單因素實驗的基礎上,選擇鹽酸水溶液pH、料液比、提取溫度和提取時間四個影響因素,每個因素選取三個水平作正交試驗,以蘿藦種子總生物堿得率為衡量實驗結果的指標,對提取工藝進行優化,以確定更好的提取工藝條件。各因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素與水平表

1.2.5 蘿藦種子總生物堿抑菌活性實驗

1.2.5.1 蘿藦種子總生物堿的提取 取脫脂后的蘿藦種子粉末10 g,加入pH為2的鹽酸水溶液200 mL,放入水浴鍋中,在70 ℃下提取2.0 h,用無菌水將得到的蘿藦種子總生物堿稀釋成濃度分別是0.8、0.6、0.4、0.2 mg/mL的蘿藦種子總生物堿溶液。

1.2.5.2 菌懸液的制備 將三種供試菌種在無菌操作臺分別接種于無菌平板上,在37 ℃培養箱培養24 h后,用接種環挑取典型菌落轉移接種在LB液體培養基中,37 ℃培養24 h,用無菌生理鹽水將其稀釋成含菌量為1×106～1×107CFU/mL的菌懸液,備用。

1.2.5.3 蘿藦種子總生物堿抑菌作用 采用牛津杯法[15]測定蘿藦種子總生物堿的抑菌作用。在生物安全柜上將滅菌后的固體培養基倒入無菌培養皿中,每個培養皿中倒入20 mL左右培養基,待冷卻凝固后,用移液槍吸取0.1 mL菌懸液加到培養基平板上,然后用無菌L型玻璃棒涂布均勻。用無菌鑷子夾取已干燥滅菌的牛津杯(內徑為6.00 mm)垂直放在含菌平板上,在每個牛津杯中分別加入200 μL(濃度為0.8、0.6、0.4、0.2 mg/mL)的總生物堿溶液,用無菌生理鹽水做對照。最后將培養皿放置37 ℃恒溫培養箱中培養24 h,觀察實驗結果,每組實驗重復三次。

1.2.5.4 最低抑菌濃度(MIC)的測定 采用兩倍稀釋法[16],將在最優條件下制備的總生物堿用無菌水稀釋成0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL濃度的稀釋液,將稀釋液分別移取2 mL至無菌培養皿中,然后分別將20 mL固體培養基倒入其中充分混勻,待其凝固后,在每個培養皿中加入0.1 mL菌懸液,涂布均勻,放入37 ℃培養箱中培養24 h,觀察細菌生長情況。以不加稀釋液的培養皿為空白對照,以無細菌生長的培養基中最低稀釋液濃度為最低抑菌濃度。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.2.1 鹽酸水溶液pH對蘿藦種子總生物堿得率的影響 由圖1可知,總生物堿隨著pH的增加(pH1.0～5.0),生物堿得率呈先增高后降低的趨勢,在pH為3的條件下,生物堿得率最高;當pH大于3時,生物堿得率隨pH的不斷增高反而下降。考慮到可能由于蘿藦種子中生物堿含有與酸發生反應的成分[17]。因此提取蘿藦種子總生物堿時,鹽酸水溶液pH為2.0、3.0、4.0作為正交試驗的三個水平。

圖1 鹽酸水溶液pH對生物堿得率的影響

2.2.2 料液比對蘿藦種子總生物堿得率的影響 由圖2可以看出,蘿藦種子總生物堿得率隨著料液比的增加呈現先增大后下降的趨勢,在料液比1∶20 g/mL時總生物堿得率達到最大值;在料液比高于1∶20 g/mL時,總生物堿得率隨著料液比增大而降低。這可能是由于在一定范圍內增加料液比有助于增大提取溶劑與浸提物的接觸面積,提高提取效率[18],但是用量過大反而不利于蘿藦種子總生物堿的溶出,降低提取效率。故選定料液比1∶20 g/mL左右。

圖2 料液比對生物堿得率的影響

2.2.3 提取溫度對蘿藦種子總生物堿得率的影響 由圖3可以看出,當溫度小于80 ℃時,隨著溫度的升高蘿藦種子總生物堿得率逐漸提高;當溫度為80 ℃時,總生物堿得率最高。這是由于溫度在80 ℃時能更好的破解細胞壁,使生物堿更容易提取出來,從而使總生物堿得率達到最佳。然而當溫度大于80 ℃時,蘿藦種子總生物堿得率反而開始下降;這是因為溫度過高,會破壞其中活性成分,增加溶質雜出量,為后續操作帶來不便[19]。因此,選擇提取溫度80 ℃左右最為合適。

圖3 提取溫度對生物堿得率的影響

2.2.4 提取時間對蘿藦種子總生物堿得率的影響 由圖4可以看出,在0.5～2.0 h的范圍內,蘿藦種子總生物堿得率隨著時間增加而逐漸升高,但是時間超過2.0 h后,總生物堿得率明顯下降。這可能是由于提取時間過長,影響一部分生物堿的結構,而且隨著時間的增加,提取溶劑的揮發也進一步影響著提取率[20]。當提取時間為2.0 h時,蘿藦種子總生物堿得率最高。因此,選擇2.0 h左右為提取時間進行響應面試驗。

圖4 提取時間對生物堿得率的影響

2.3 正交試驗結果及數據分析

由表2可知,極差的大小反映了實驗因素對考察指標的影響程度,極差越大,實驗因素對蘿藦種子總生物堿得率的影響就越大。因此,在四個影響蘿藦種子總生物堿提取工藝的因素中,對總生物堿得率的影響作用大小是:鹽酸水溶液pH>提取溫度>提取時間>料液比。蘿藦種子總生物堿的最佳提取工藝是A1B2C2D1,即鹽酸水溶液pH為2、料液比1∶20 g/mL、提取時間2.0 h、提取溫度70 ℃。

表2 正交實驗設計及結果

由表3可知,鹽酸水溶液pH、提取溫度對蘿藦種子總生物堿得率有顯著影響,提取時間和料液比對蘿藦種子總生物堿得率的影響不顯著。

表3 正交試驗方差分析

2.4 驗證試驗

為了進一步考察以上優化工藝的可行性,取蘿藦種子粗粉三份,每份各10 g,按照優選出的最佳工藝進行提取:鹽酸水溶液pH為2.0、料液比1∶20 g/mL、提取時間2.0 h、提取溫度70 ℃。按1.2.1的實驗方法進行檢驗,得出總生物堿平均得率為2.91%,該結果高于正交實驗其他組合,表明該提取條件穩定可行。

2.5 蘿藦種子總生物堿抑菌活性實驗結果

2.5.1 蘿藦種子總生物堿的抑菌效果 蘿藦種子總生物堿對三種供試菌種的抑菌效果見表4。由表4可以看出蘿藦種子總生物堿除了對大腸桿菌沒有抑菌效果外,對其他兩種菌均有不同程度的抑菌效果。其中,蘿藦種子總生物堿對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最強,其次是枯草芽孢桿菌。不同濃度的提取物對供試菌種的抑菌效果也不同,隨著濃度的增高,其抑菌效果也逐漸增強。由此得出,蘿藦種子總生物堿具有一定的抑菌活性。

表4 不同濃度的蘿藦種子總生物堿抑菌效果

2.5.2 蘿藦種子總生物堿最低抑菌濃度(MIC)的測定 如表5所示,蘿藦種子總生物堿對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(MIC)為0.2 mg/mL,對枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度(MIC)為0.4 mg/mL。蘿藦種子總生物堿對金黃色葡萄球菌抑菌效果最大,對枯草芽孢桿菌次之,對大腸桿菌沒有抑菌活性,抑菌活性隨著生物堿濃度的增大而加強。

表5 蘿藦種子總生物堿對供試菌種的最低抑菌濃度(MIC)

3 結論

本實驗在單因素實驗的基礎上,采用正交實驗對蘿藦種子總生物堿的提取工藝進行優化,確定蘿藦種子總生物堿的最佳提取工藝是:鹽酸水溶液pH為2、料液比1∶20 g/mL,提取時間2.0 h,提取溫度70 ℃,在此工藝下蘿藦種子總生物堿得率為2.91%。抑菌實驗表明,蘿藦種子總生物堿對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均有抑菌效果,MIC分別為0.2、0.4 mg/mL,尤其對金黃色葡萄球菌抑菌作用最強,對大腸桿菌沒有抑菌作用。本實驗為開發和利用蘿藦種子資源提供一定的理論依據,也有助于進一步研究蘿藦種子生物堿的價值。