天然和熱變性乳鐵蛋白與姜黃素復合物的結構表征及結合機理研究

鄧楚君,許琳霜,李 波,楊 偉

(河南科技學院食品學院,河南新鄉 453003)

姜黃素(Cur)是從姜黃根莖中提取分離出的一種多酚類物質,具有抗菌和抗氧化等多種生物活性[1-4]。但其水溶性較差,生物利用率低,嚴重限制了其在食品體系中的應用。研究表明,利用食品傳遞體系能夠有效提高Cur的水溶性和生物利用率,如納米顆粒[5]和納米乳液[6]等。

蛋白質能夠作為壁材,用于包埋、傳遞食品功能因子[7]。乳鐵蛋白(LF)是一種單鏈的球狀糖蛋白。與其他蛋白質不同,LF具有多種生物活性功能,如抗菌、抗炎和免疫調節等[8-9]。

許多研究表明,球狀蛋白可通過熱變性形成納米顆粒和微米顆粒[10-11]。Sneharani等[12]發現熱變性β-乳球蛋白比天然β-乳球蛋白具有更高的運載Cur的能力。當LF在85 ℃條件下加熱時,蛋白質構象發生改變,疏水性增加[13-14],因而可能有利于其與疏水性多酚(如Cur)形成復合物。Yamauchi等[15]研究表明,熱變性LF能夠形成納米顆粒。然而,目前沒有關于天然和熱變性LF與Cur相互作用的研究報道。

本文采用多種光譜學方法研究了LF-Cur復合物的結構和相互作用機制。通過濁度法和動態光散射研究了復合物的顆粒特性,應用紅外光譜和圓二色譜研究了LF-Cur復合物的結構特性,采用熒光光譜比較研究了Cur與天然和熱變性LF的結合常數和結合位點數,以期為LF-Cur復合物在食品中的應用提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

LF(純度>92%) 新西蘭國際有限公司;Cur(純度>98%) 美國Sigma公司;乙酸鈉、冰乙酸 天津市德恩化學試劑有限公司;溴化鉀 上海譜振生物科技有限公司;其他化學試劑均為分析純。

HACH 2100N型濁度儀、DR390型可見光分光光度計 美國哈希公司;Zetasizer Nano-ZS90型納米激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司;Spectrum Tensor27型傅立葉變換紅外光譜儀 德國布魯克科技有限公司;Pistar π-180型圓二色光譜 英國應用光物理公司;熒光分光光度計 美國安捷倫科技有限公司;THZ-82型水浴恒溫振蕩器 江蘇金壇億通電子有限公司;JA1003N型電子天平 上海菁海儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 復合物的制備 在室溫下,溶解一定量的LF于pH5.0、0.01 mol/L的醋酸緩沖液中,持續攪拌2 h,使LF在緩沖液中的最終濃度為4×10-4mol/L。同時,配制5.4×10-3mol/L的Cur無水乙醇溶液。

天然LF-Cur復合物制備:將天然LF(記為LF25 ℃)與不同濃度的Cur溶液等體積混合,使混合溶液中LF的終濃度為2×10-4mol/L,Cur的終濃度分別為0、1.4×10-5、2.7×10-5、5.4×10-5、8.1×10-5和1.08×10-4mol/L。

熱變性LF-Cur復合物制備:將天然LF溶液裝入直徑1 cm的塑料管中,于90 ℃的恒溫水浴中加熱20 min。熱處理后,將樣品立即放入冰水中冷卻以防止進一步變性。取熱變性的LF(記為LF90 ℃)與不同濃度的Cur溶液等體積混合,使混合溶液中LF的終濃度和Cur的終濃度與天然LF-Cur復合物中保持一致。

其中,天然和熱變性LF-Cur混合溶液中乙醇的最終濃度為2%(該乙醇濃度不會引起LF變性)。

1.2.2 濁度和粒徑測定 取3 mL天然/熱變性LF-Cur復合物溶液(Cur濃度分別為0、1.4×10-5、2.7×10-5、5.4×10-5、8.1×10-5和1.08×10-4mol/L)于試樣瓶中,擦拭干凈試樣瓶外壁,放入濁度儀測定溶液的濁度數值并記錄[16]。取1 mL Cur濃度分別為0、1.4×10-5、2.7×10-5、5.4×10-5、8.1×10-5和1.08×10-4mol/L的天然/熱變性LF-Cur復合物溶液于玻璃皿中,采用納米激光粒度儀分析復合物的粒徑大小與粒徑分布(PDI),掃描次數12次[17]。測定溫度均為25 ℃,散射角165°。每個樣品測定3次,結果以平均值表示。

1.2.3 ζ-電位測定 取1 mL Cur濃度分別為0、1.4×10-5、2.7×10-5、5.4×10-5、8.1×10-5和1.08×10-4mol/L的天然/熱變性LF-Cur復合物溶液于電位皿中,采用納米激光粒度儀測定復合物的ζ-電位。測定溫度為25 ℃,掃描次數30次,每個樣品測定3次,結果以平均值表示[18]。

1.2.4 圓二色光譜(CD)分析 取0.1 mL Cur濃度分別為5.4×10-5和1.08×10-4mol/L的天然/熱變性LF-Cur復合物溶液于石英比色皿中,掃描波長為190～250 nm,響應時間2 s。使用在線圓二色光譜網站(http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk)[19]對數據進行分析。圓二色光譜圖為三次測量結果的平均值。

1.2.5 傅立葉變換紅外(FTIR)光譜分析 LF-Cur復合物(Cur的濃度為1.08×10-4mol/L)經過旋轉蒸發除去乙醇,冷凍干燥后得到復合物粉末。分別取LF、Cur及LF-Cur復合物干燥粉末2 mg與200 mg溴化鉀研細均勻后制成透明薄片,進行FTIR分析。測定波數為500～4000 cm-1,掃描次數為11次,分辨率為4 cm-1[20]。

1.2.6 熒光光譜分析 參考文獻[21-22]方法,并做適當修改。取LF與不同濃度的Cur溶液等體積混合,使溶液中LF濃度為2×10-4mol/L,Cur濃度分別為2.71×10-6、5.43×10-6、8.14×10-6、1.086×10-5、1.629×10-5、2.172×10-5和2.715×10-5mol/L。在25 ℃靜置2 h,然后進行熒光測定。激發波長設定為292 nm,激發和發射的狹縫寬度分別為5和10 nm[18]。熒光淬滅數據通過Stern-Volmer方程式(1)進行分析。

式(1)

式中:F0和F分別為不加Cur和添加Cur時的熒光強度;Kq為分子淬滅常數;τ0是沒有淬滅劑時的熒光壽命;[Q]為Cur的濃度;Ksv為Stern-Volmer淬滅常數。結合常數Ka和結合位點數n通過雙對數方程式(2)進行分析。

式(2)

式中:Ka為結合常數;n為結合位點數。

1.2.7 包埋率和運載率測定 參考文獻[23]方法,并做適當修改。取10 mL Cur終濃度分別為0、1.4×10-5、2.7×10-5、5.4×10-5、8.1×10-5和1.08×10-4mol/L的天然/熱變性LF-Cur復合物溶液于50 mL離心管中,在20000 r/min 條件下離心10 min。收集上清液,采用分光光度計在427 nm處測定Cur的吸光度;同時繪制標準曲線(y=6.31916x-0.44581,R2=0.9994)。所有測定均在25 ℃條件下進行。

包埋率(%)=上清液中Cur的量(mg)×100/總Cur的量(mg)

式(3)

1.3 數據處理

數據統計分析使用SPSS 16.0 for Windows軟件(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)進行方差分析(ANOVA)和動力學回歸分析,顯著性水平為0.05,圖表中小寫字母不同表示在5%水平上差異顯著(p<0.05)。多重比較采用LSD法。所有試驗重復兩次,所有分析檢測試驗重復三次,測定結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 濁度和粒徑分析

圖1為LF-Cur復合物濁度隨Cur濃度的變化曲線。由圖 1可知,隨著Cur濃度的增加,LF25 ℃-Cur復合物的濁度迅速增加;當Cur濃度為1.08×10-4mol/L時,濁度為(165±6.34)NTU。LF90 ℃-Cur復合物的濁度隨Cur濃度的增加變化較小,由(0.75±0.12)NTU(Cur濃度為1.4×10-5mol/L)增加到(5.1±3.73)NTU(Cur濃度為1.08×10-4mol/L)。

圖1 LF-Cur復合物濁度隨Cur濃度的變化曲線

圖2為LF-Cur復合物粒徑隨Cur濃度的變化曲線。單獨LF25 ℃和LF90 ℃的粒徑分別為(12.65±0.48)和(29.96±0.61)nm。這是因為LF在90 ℃加熱時發生聚集,從而導致熱變性LF粒徑的增加[24]。由圖2可知,隨Cur濃度的增加,LF-Cur復合物粒徑增加:當Cur濃度為(1.4～2.7)×10-5mol/L時,粒徑為13.32～15.18 nm;當Cur濃度進一步增加(從5.4×10-5mol/L增加到1.08×10-4mol/L),粒徑由135.9 nm增加到334.9 nm,表明溶液中形成了更大的聚集體,這與濁度結果分析一致。研究表明,多酚能夠與蛋白質結合形成復合物。當多酚含量較高時,結合在蛋白質表面的多酚能夠通過橋聯作用,使蛋白質-多酚復合物形成具有較大粒徑的亞穩定狀態的分散體[25-26]。Chen 等[27]研究表明,大豆分離蛋白-Cur復合物之間能夠通過姜黃素的相互作用而結合,從而形成較大的顆粒。

圖2 LF-Cur復合物粒徑隨Cur濃度的變化曲線

由圖2可知,相對于LF25 ℃-Cur復合物,LF90 ℃-Cur復合物的粒徑變化較小。Cur濃度為1.4×10-5～1.08×10-4mol/L時,LF90 ℃-Cur復合物均為納米顆粒(31.77～95.12 nm)。此外,隨著Cur濃度的增加,LF90 ℃-Cur復合物粒徑分布減小(PDI值從0.61降低到0.24),表明LF90 ℃-Cur復合物顆粒分布較為均一。

相比LF25 ℃-Cur復合物,LF90 ℃-Cur復合物的濁度和粒徑變化較小。這可以歸因于兩個方面。一方面,LF90 ℃-Cur復合物的ζ-電位較大,復合物之間排斥力較強,不容易聚集,因此,濁度和粒徑較小[28]。另一方面,由于熱誘導的作用,LF變性,結構展開。在這一過程中,LF90 ℃可能會失去部分存在于表面的Cur結合位點,但同時暴露出位于LF90 ℃結構內部的結合位點。此時更多的Cur與這些結合位點結合。但由于空間位阻等作用,Cur不能夠發揮“橋聯”作用[29]。因此,LF90 ℃-Cur復合物主要是納米顆粒,其濁度和粒徑均較小。

2.2 ζ-電位分析

圖3為Cur濃度對LF-Cur復合物ζ-電位的影響。單獨LF25 ℃和LF90 ℃的ζ-電位分別為(7.72±0.35) mV和(8.20±0.19) mV。單獨LF90 ℃的ζ-電位高于LF25 ℃,這與蛋白質90 ℃加熱后,LF的兩個葉片連續展開,最初位于LF疏水內部的更多陽離子基團暴露于溶液中,導致單獨LF90 ℃ζ-電位的增加有關[30]。

圖3 Cur濃度對LF-Cur復合物電位的影響

由圖3可知,隨著Cur濃度的增加,LF-Cur復合物的ζ-電位增加。這可能與Cur的添加導致LF結構的改變有關。該結果與Teng等[31]的相關研究結果一致。通常,溶液中顆粒帶電荷越多,顆粒間聚集的可能性越小,溶液穩定性越高。LF90 ℃-Cur復合物的ζ-電位高于LF25 ℃-Cur復合物,這有利于提高復合物溶液的穩定性;同時,也解釋了LF90 ℃-Cur復合物具有的較低濁度和粒徑。

2.3 圓二色譜(CD)分析

如圖4a1所示,在190～260 nm范圍內,LF25 ℃的圓二色光譜有一個較寬的、位于208～210 nm中心的負峰和一個218～220 nm處的肩峰。與LF25 ℃相比,LF90 ℃的圓二色光譜圖(形狀和強度)發生了明顯變化,表明加熱使LF變性,蛋白質二級結構改變。當加入1.08×10-4mol/L Cur時,LF25 ℃和LF90 ℃的峰值減小,表明Cur能夠誘導LF二級結構變化。

圖4 LF和LF-Cur復合物遠紅外圓二光譜圖(a1)和二級結構含量(a2)

通過DICHROWEB程序計算得到LF二級結構的含量[32]。通過SELCON3計算了α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲的比例,如圖4a2所示。LF25 ℃和LF90 ℃的二級結構中α-螺旋結構含量較低(LF25 ℃和LF90 ℃分別為21%和18%),β-折疊含量較高(LF25 ℃和LF90 ℃分別為32%和35%)。加熱變性導致LF中的α-螺旋含量顯著減小(p<0.05),β-折疊含量顯著增加(p<0.05),而β-轉角和無規卷曲差異不顯著(p>0.05)。該結果表明,熱變性能夠穩定LF中的β-折疊結構;同時,使LF結構更為伸展。添加5.4×10-5和1.08×10-4mol/L Cur后,LF在LF25 ℃-Cur復合物和LF90 ℃-Cur復合物中的二級結構有不同程度的改變。其中,α-螺旋含量減少(p<0.05)。但β-折疊、β-轉角和無規卷曲含量變化不顯著(p>0.05)。也有研究表明:Cur不能引起β-乳球蛋白二級結構發生顯著變化,這可能與Cur主要吸附在蛋白質表面有關[12]。

2.4 傅立葉變換紅外(FTIR)光譜

圖5為LF和LF-Cur復合物(Cur含量為1.08×10-4mol/L)的紅外光譜。FTIR圖譜顯示LF25 ℃-Cur亞微米顆粒與LF90 ℃-Cur納米顆粒之間存在一些明顯的結構差異。

圖5 傅里葉變換紅外光譜

如圖5a所示,Cur在3504 cm-1有一個特征峰,來自于-H鍵的伸縮振動;在1509和1028 cm-1處有兩個特征峰,分別來自于酮基的伸縮振動和-NH的形變[33]。1605、1435和1285 cm-1的特征峰分別來自于苯環的伸縮振動、C-H彎曲振動和C-O伸縮振動[34]。在LF-Cur復合物的光譜中(圖5d與圖5e),Cur在3504、1509、1028、964和810 cm-1處的特征峰均消失,說明Cur與LF發生了結合。Liu等[35]在研究卵白蛋白與Cur復合物時也觀察到類似的現象。如圖5(b～e)所示,所有復合物在3300 cm-1附近均有一個較寬的峰,這與分子間H鍵和O-H伸縮振動有關。LF-Cur復合物與單一LF相比,3300 cm-1附近的峰型均有一定的變化,表明LF與Cur之間存在氫鍵作用[36]。該結果與文獻[37-38]研究結果一致,表明多酚能夠通過氫鍵部分得與蛋白質發生結合。

天然LF在1653 cm-1處和熱變性LF在1654 cm-1處的吸收峰為酰胺Ⅰ帶的C=O伸縮振動[39-40];如表1,LF25 ℃在1535 cm-1處和LF90 ℃在1541 cm-1處的吸收峰為酰胺Ⅱ帶的N-H彎曲振動和C-N伸縮振動[41-43]。C=O鍵和C-N鍵的伸縮振動均與蛋白質二級結構單元間的氫鍵有關[44]。添加Cur(1.08×10-4mol/L)前后,LF在酰胺I帶(1600～1700 cm-1處)沒有明顯差異,但在酰胺II帶(1535 cm-1處)有明顯紅移(約4 cm-1)。LF25 ℃的酰胺II帶從1535和1450 cm-1分別紅移至1530和1444 cm-1;而LF90 ℃的酰胺II的峰從1455 cm-1藍移至1456 cm-1。上述結果表明Cur與蛋白質亞基結構中的C=O和C-N基團發生了相互作用。

表1 LF與LF-Cur復合物傅里葉變換紅外光譜的峰值

2.5 Cur與天然LF和熱變性LF結合常數和結合位點的比較

由圖6可知,加熱處理后LF的熒光強度增加(約66.81%),這與熱變性使得LF兩葉依次展開,其構象發生了不可逆的改變有關[24]。隨著Cur濃度的升高,LF的熒光強度逐漸減小,表明LF與Cur之間存在結合行為(圖6)。在Cur存在下,LF25 ℃和LF90 ℃的λem有明顯的藍移現象(LF25 ℃從346 nm藍移至337 nm,LF90 ℃從350 nm藍移至341 nm),這可能與Cur結合到LF的疏水區域有關[45]。

圖6 LF-Cur復合物熒光光譜圖

通過Stern-Volmer方程(式(1))和雙對數方程(式(2))研究了Cur與LF的結合機制(圖7)。表2總結了公式(1)和(2)的相關數據。在Stern-Volmer回歸曲線的線性范圍內,LF25 ℃和LF90 ℃的平均淬滅常數(Ksv)分別為2.69×104M-1和2.47×104M-1。有研究表明,色氨酸的τ0在2.33±0.15 ns與3.16±0.1 ns之間[46]。取τ0值3.16±0.1 ns進行計算,得到kq值分別為8.5×1012M-1s-1和7.8×1012M-1s-1,遠高于2.0×1010M-1s-1(動態淬滅最大值)[47]。因此,LF與Cur的相互作用為靜態淬滅過程。對于靜態淬滅,雙對數Stern-Volmer方程(公式(2))可以用于分析計算LF-Cur復合物形成過程的結合常數(Ka)和結合位點數(n)。由表2可知,與Cur的Ka和結合位點數(n)高于LF25 ℃,表明熱變性LF與Cur的結合能力較強。

表2 Cur與天然或熱變性LF相互作用的Stern-Volmer淬滅常數、結合常數和結合位點數

圖7 Stern-Volmer方程(a1,a2)和雙對數方程擬合圖(b1,b2)

2.6 包埋率

表3為Cur在LF25 ℃-Cur復合物和LF90 ℃-Cur復合物的包埋率。由表3可知,與在LF25 ℃-Cur復合物中相比,Cur在LF90 ℃-Cur復合物中的包埋率顯著提高。有研究表明,蛋白質疏水性提高有利于其與Cur結合[48]。另外,隨Cur濃度的增加,LF對Cur的包埋率均減小,其中天然LF對Cur的包埋率從41.11%±1.71%下降到13.72%±1.77%,熱變性LF對Cur的包埋率從62.40%±1.02%下降到26.01%±2.02%。Teng等[31]研究了β-乳球蛋白包埋運載Cur,結果表明,隨著Cur濃度的增加,包埋率減小。

表3 LF-Cur復合物中Cur包埋率(%)

3 結論

LF-Cur復合物的濁度和粒徑與Cur濃度和LF結構密切相關。當Cur濃度為(1.4～5.4)×10-5mol/L時,天然LF-Cur復合物為納米顆粒,溶液濁度低;當Cur濃度為8.1×10-5～1.08×10-4mol/L時,天然LF-Cur復合物為亞微米顆粒,溶液濁度高。熱變性LF-Cur復合物均為納米顆粒,溶液濁度低。紅外光譜和圓二光譜表明,Cur能夠改變天然和熱變性LF的二級結構結構。熒光光譜表明,Cur與天然和熱變性LF的結合均為靜態淬滅過程,且熱變性LF與Cur的結合能力較強,熱變性能夠提高LF對Cur的包埋率。本研究為開發基于LF為載體運載疏水性多酚提供了理論依據。