UPLC-MS/MS法同時測定動物油脂中11種喹諾酮類獸藥殘留

董昕/品測（上海）檢測科技有限公司

0 引言

喹諾酮類藥物（fluoroquinolones,FQs）是一種人工合成的廣譜抗菌藥。因其具有性質穩定、價格便宜、抗菌譜廣、抗菌活性強等優點，常作為飼料添加劑來預防和治療動物疾病[1]。但FQs會在動物體內產生殘留，嚴重危害人體健康。歐盟、美國、日本等國相繼制定了喹諾酮類在動物組織中的最高殘留限量。2002年中國農業部235號公告規定了牛、羊脂肪中的達氟沙星、二氟沙星、恩諾沙星的MRLs值為100 μg/kg。2016年中國農業農村部2292號公告中禁止在動物食品中使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星[2]。禽畜產品中喹諾酮類藥物的殘留情況作為繼瘦肉精之后的又一個重點予以監控，建立高效可靠的喹諾酮殘留檢測的方法勢在必行。

喹諾酮類藥物的檢測方法有微生物檢測法、免疫法（酶聯免疫法和免疫親和色譜法）、光譜法、高效液相色譜及液質聯用技術等[3]。這些方法針對的基質主要是動物肌肉組織。喹諾酮類藥物經過食物鏈富集作用主要積聚于動物的肌肉和脂肪，而針對動物油脂中喹諾酮類藥物的檢測，相關的國家標準方法和文獻都較少。本實驗以11種喹諾酮藥物為研究對象，建立了動物油脂中喹諾酮類藥物殘留的檢測方法，為動物油脂類產品中獸藥殘留的監測提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑及材料

液相色譜-串聯質譜儀（Waters公司，H-CLASS型液相，配AB公司API-5500 Triple Quad型串聯質譜檢測器）；ME204型分析天平(瑞士梅特勒公司托利多)；超純水系統 (美國Millipore公司)；高速冷凍離心機(湖南湘儀公司)；Talboys旋渦振蕩器(美國Talboys公司)、超聲儀（上海安譜公司）。

正己烷（色譜純）、乙腈（色譜純）、丙酮（色譜純）、甲醇（色譜純）、甲酸（色譜純）、凈化柱（PRIME HLB柱）：6 mL、200 mg或相當者（沃特世公司）。色譜柱 ：BEH C18 2.1×50 mm，1.7 μm（沃特世公司）。

11種喹諾酮類獸藥標準物質（氧氟沙星、培氟沙星、諾氟沙星、洛美沙星、環丙沙星、達氟沙星、二氟沙星、恩諾沙星、氟甲喹、惡喹酸、沙拉沙星），純度≥98%，由上海安譜實驗科技有限公司提供。市售豬油。

1.2 樣品提取

稱取1.0 g試樣于離心管中，加入5 mL正己烷渦旋溶解，加入10 mL 80%乙腈水（0.1%甲酸）溶液渦旋5 min，常溫超聲10 min，4 000 r/min冷凍 （4℃）離心5 min，取下層乙腈水層上樣PRIME HLB小柱，濾出液過0.22 μm濾膜后供LC-MS/MS檢測。

1.3 標準溶液的配置及標準工作曲線

標準儲備液：分別準確稱取11種喹諾酮類獸藥 10 mg（精確到 0.1 mg），至 10 mL 棕色容量瓶中用甲醇定容至分度，得到各喹諾酮類標準儲備液（1 000 μg/mL）。于 -20 ℃以下避光儲存，使用期限不超過6個月。

標準工作液：分別量取適量的喹諾酮標準儲備液，用20%乙腈水稀釋制備成0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL 的系列標準工作液。

1.4 液相色譜條件

色譜柱：BEH C18，2.1 mm×50 mm，1.7 μm；流動相：A乙腈 B 0.1%甲酸+2 mmol/L甲酸銨水；流速：0.3 mL/min；進樣量：2 μL；色譜柱溫度：30 ℃；洗脫梯度 ：0 min（10%A） 0.5 min（10%A） 1.5 min（30%A）3.0 min（90%A）4.0 min（90%A）4.01 min（10%A） 5.0 min（10%A）。

1.5 質譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描模式：MRM；掃描時間窗口設置：0～5 min；氣簾氣：30 psi；碰撞氣：Medium；離子化電壓：5 500 V；離子源溫度：600 ℃；噴霧氣：50 psi；輔助加熱氣：60 psi；母離子，子離子及去簇電壓，碰撞能量保留時間見表1。

2 實驗結果

2.1 標準曲線的繪制

根據每種化合物的響應強弱，配制不同濃度的系列標準溶液。以各化合物峰面積(Y)對其濃度(X，μg/L)繪制標準曲線，結果表明每個化合物在各自的濃度范圍內具有良好的線性關系，其相關系數r均不低于0.99（表2）。

表1 液相色譜串聯質譜11種喹諾酮類獸藥母離子，子離子及去簇電壓，碰撞能量

以空白油脂樣為樣品，加入喹諾酮類標準物質，按照1.2方法進行處理，依照不同倍數稀釋，通過LC-MS/MS檢測，以定量離子信噪比（S/N）≥10為界限，確定其最低檢出限，以稱樣量1.0 g計，得最低檢出限為 1.0 μg/kg。

表2 液相色譜-串聯質譜法11種喹諾酮標準曲線

2.2 結果計算

X=CV/m

式中：X——試樣中各喹諾酮類藥物含量，μg/kg；

m——樣品質量，g；

V——樣品定容體積，mL；

C——測定用樣液中各喹諾酮類藥物濃度，ng/mL

2.3 回收率及重現性實驗

以豬油為樣品，加入標準溶液，加標量值分別為1倍檢出限、2倍檢出限、10倍檢出限進行6平行試驗，按照1.2方法分別進行處理，通過LCMS/MS 分析（結果見表 3）。加標量 1.0 μg/kg，各喹諾酮類藥物平均回收率88.2%～97.9%，精密度1.23%～5.69%；加標量 2.0 μg/kg，各喹諾酮類藥物平均回收率87.5%～96.5%，精密度1.83%～3.37%；加標量10.0 μg/kg，各喹諾酮類藥物平均回收率88.8%～93.6%，精密度1.52%～5.18%；符合回收率在80%～110%之間，精密度≤10%要求。

表3 豬油試樣PRIME HLB柱回收率添加實驗結果

3 結果討論

3.1 提取和凈化

針對動物油脂的特點，其主要成分是脂肪酸，易溶于非極性溶劑，比較石油醚，環己烷，正己烷，發現油脂在正己烷中溶解最佳，因此本實驗選擇正己烷為溶劑。溶解油脂樣品后采用乙腈、酸化乙腈、酸化乙腈水分別提取。酸化乙腈相較于乙腈，提取效果更優；對于使用PRIME HLB柱，發現在乙腈水比例為8∶2時（0.1%甲酸）提取效率和對PRIME HLB柱的通過率均最佳，因此選取80%乙腈水（0.1%甲酸）為提取溶劑。

喹諾酮類藥物結構中分子都含有羧基和哌嗪基，顯示出酸堿兩性，易溶于酸性或堿性溶液。通過80%乙腈水（0.1%甲酸）提取后，提取液直接通過PRIME HLB柱凈化。PRIME HLB柱是在水可浸潤性Oasis吸附劑為基礎而特殊設計的一種SPE,它無需活化和平衡步驟能去除95%以上基質干擾物（比如鹽，蛋白和磷脂），并且溶液流速更快，使得整個操作更順暢、快速，且對油脂有很好的凈化效果，有很好的適用性，適合推廣使用。

3.2 色譜質譜條件優化

本方法優化了色譜質譜條件，采用超高效液相色譜-串聯質譜儀檢測11種喹諾酮，使用BEHC18色譜柱，以乙腈和0.1%甲酸+2 mmol/L甲酸銨水為流動相，梯度洗脫，流速為0.3 mL/min,能使得11種喹諾酮得到很好的分離，發揮了質譜的高通量特性，使整個分析時間縮短到5.0 min以內，大大地縮短了11種喹諾酮類的分析檢測時間，提高檢測靈敏度，且無雜質干擾，節省了溶劑的耗費和檢測的時間成本。11種喹諾酮類總離子流見圖1，陰性豬油樣品總離子流見圖2。

4 結語

圖1 11種喹諾酮類總離子流

圖2 陰性豬油樣品總離子流

本研究建立了超高效液相色譜-串聯質譜法測定動物油脂中11種喹諾酮類藥物的檢測方法。采用固相萃取柱凈化，BEHC18色譜柱超高效液相色譜分離，串聯質譜檢測器檢測。實驗結果表明，采用正己烷溶解油脂樣品，經PRIME HLB柱凈化，BEHC18色譜柱超高效液相色譜-串聯質譜法分析，流程簡便，結果準確。本方法提取效率高，凈化過程簡單，靈敏度高，分析時間短，回收率滿意，適合推廣。