單核細(xì)胞增生李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)凍干保存方法*

羅超 李妍 趙珂珂 李智瑋 劉剛/上海市計(jì)量測試技術(shù)研究院

0 引言

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，涉及生物安全、食品安全等相關(guān)的微生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、微生物檢測方法、有效分析測量手段和量值溯源技術(shù)儼然是一個(gè)重要課題。微生物檢測過程由于受到個(gè)體差異影響，同時(shí)對于環(huán)境污染特別敏感，絕大多數(shù)情況對于同一樣品無法復(fù)檢，所以急需加提高微生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制能力。通過使用具有明確量值、基體接近實(shí)際樣品的微生物菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)微生物檢測結(jié)果質(zhì)量控制，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、公正性[1-3]。

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）簡稱單增李斯特菌，是一種人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多。它廣泛存在于自然界中，食品中存在的單增李氏菌對人類的安全具有危險(xiǎn)，該菌在4 ℃的環(huán)境中仍可生長繁殖，是冷藏食品中威脅人類健康的主要病原菌之一，因此，在食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)中，必須加以重視[4,5]。

對單增李斯特活菌凍干過程中添加的保護(hù)劑種類和含量進(jìn)行篩選研究，比較不同配方保護(hù)劑對活菌凍干后及長時(shí)間低溫存放后存活率的影響，從而篩選出一種保護(hù)劑配方，為后續(xù)微生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

生物安全柜（美國Labconco公司）；冷凍干燥機(jī)（美國Labconco公司）；恒溫培養(yǎng)箱（上海慧泰儀器制造有限公司）；高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；Milli-Q純水儀（美國默克公司）；電子天平（美國Mettler Toled公司）；超低溫冰箱（美國thermo公司）；拍打氏均質(zhì)器（法國Interscience公司）。

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 菌株編號19115）；李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）；李氏菌增菌肉湯（LB1，LB2）（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）；胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂（TSA-YE）（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）；磷酸鹽緩沖液（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）；0.85%無菌生理鹽水（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）；肉粉（上海市計(jì)量測試技術(shù)研究自制）；脫脂牛奶（德運(yùn)公司）；聚乙烯吡咯烷酮（國藥集團(tuán)）；酪氨酸（國藥集團(tuán)）；蔗糖（國藥集團(tuán)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種復(fù)活、鑒定與培養(yǎng)

將冷凍保存的標(biāo)準(zhǔn)菌株在血營養(yǎng)平板瓊脂上劃線復(fù)活，37 ℃培養(yǎng)18～24 h。從平板上挑取單個(gè)單增李斯特菌落接種到營養(yǎng)肉湯中，37 ℃，培養(yǎng)18～24 h，取菌液接種到 TSA-YE 培養(yǎng)基上，37 ℃至長出菌落后，進(jìn)行革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察，細(xì)菌排列呈短桿狀，大小約為（0.4～0.5 μm）×（0.5～2.0 μm）。隨機(jī)挑取菌落用VITEK全自動生化分析儀進(jìn)行鑒定，挑取純培養(yǎng)的單個(gè)菌落穿刺SIM動力培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)48 h，在SIM培養(yǎng)基上方呈傘狀生長。挑取純培養(yǎng)的單個(gè)菌落穿刺到血平板上，37 ℃培養(yǎng)48 h，溶血圈狹窄、清晰、明亮。綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終鑒定為單增李斯特菌。

1.2.2 不同保護(hù)劑的滅菌和復(fù)水方式考察

常用的滅菌方式有高壓蒸汽滅菌、過濾滅菌、輻射滅菌[6]。其中高壓蒸汽滅菌法是可殺滅包括芽胞在內(nèi)的所有微生物的一種滅菌方法，是滅菌效果中最好的。適用于普通培養(yǎng)基、生理鹽水、手術(shù)器械、玻璃容器及注射器、敷料等物品的滅菌；過濾滅菌法是用細(xì)菌不能通過致密具孔濾材的原理以除去氣體或液體中微生物的方法，常用于氣體、熱不穩(wěn)定的藥品溶液或原料的除菌；輻射滅菌法是利用紫外輻射和電離輻射殺滅微生物，如殺滅空氣中或物體表面的微生物，其特點(diǎn)是不升高產(chǎn)品溫度，穿透力強(qiáng)，滅菌效率高，但設(shè)備費(fèi)用較高，對操作人員存在潛在危險(xiǎn)性，可能使某些藥物（特別是溶液型）藥效降低或產(chǎn)生毒性或發(fā)熱物質(zhì)等[7]。

本實(shí)驗(yàn)采用高壓蒸汽滅菌（121 ℃，20 min和115 ℃，20 min）和過濾滅菌兩種方法進(jìn)行保護(hù)劑的滅菌方法考察。首先將各保護(hù)劑成分按照適當(dāng)比例配制，然后分別進(jìn)行高壓蒸汽滅菌（蔗糖和脫脂牛奶因不耐高溫需采用115 ℃滅菌，其余保護(hù)劑成分均采用121 ℃滅菌20 min的方式）和過濾滅菌（采用孔徑為 0.45 μm 的濾膜）。

由于后期研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)將以菌粉加肉粉的混合粉末方式制備，所以需考察混合粉末的復(fù)水方法，針對9.9 g肉粉和0.1 g菌粉混合后的樣品復(fù)水計(jì)數(shù)方式，具體設(shè)計(jì)了三種復(fù)水方法：

1）將樣品加入 100 mL PBS 復(fù)水后直接使用平板涂布法進(jìn)行計(jì)數(shù)；

2）將肉粉樣品加入帶濾網(wǎng)的均質(zhì)袋，加入100 mL PBS復(fù)水，經(jīng)過拍打式均質(zhì)器拍打均勻后，取清液使用平板涂布法進(jìn)行計(jì)數(shù)；

3）將樣品加入100 mL PBS復(fù)水，然后將樣品在磁力攪拌機(jī)上充分混勻，吸取上清液使用平板涂布法進(jìn)行計(jì)數(shù)。

本實(shí)驗(yàn)將0.1 g純菌粉使用平板涂布法進(jìn)行計(jì)數(shù)的結(jié)果設(shè)為陽性對照。

1.2.3 凍干保護(hù)劑的篩選方法

由于不同比例的凍干保護(hù)劑，對樣品的作用有很大的影響，因此，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化保護(hù)劑的具體成分。將脫脂牛奶、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、酪氨酸四種凍干保護(hù)劑設(shè)計(jì)為單因素試驗(yàn)，其水平設(shè)計(jì)見表1。選擇L9（34）正交表安排實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。將新鮮培養(yǎng)的單增李斯特菌懸液，按適當(dāng)?shù)捏w積比添加到保護(hù)劑中混合均勻，用無菌移液器分裝至凍干瓶中，在-80 ℃冰箱中預(yù)凍2 h以上后按照凍干程序凍干。然后將凍干好的細(xì)菌菌粉用拍打式均質(zhì)器拍碎后混勻。隨機(jī)抽取樣品三次，每次0.1 g, 對冷凍干燥前后的活菌數(shù)進(jìn)行測定，得出保護(hù)率（保護(hù)率/%=冷凍干燥后活菌數(shù)/冷凍干燥前活菌數(shù)×100）。獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)A、B、C三次，以保護(hù)率為指標(biāo)，記錄檢測結(jié)果。

表1 凍干保護(hù)劑單因素添加水平設(shè)計(jì)

表2 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4 樣品制備方法

在冷凍干燥的過程中，溫度降低和水分蒸發(fā)（冰晶體的形成）對菌種活性會造成很大的影響，為了提高菌種在冷凍干燥過程中的存活率，向菌液中加入保護(hù)劑是一種非常有效的方法，保護(hù)劑的種類較多，主要分四種類型：滲透型抗凍劑、非滲透型抗凍劑、抗氧化劑、膠體。研究表明，不同比例的保護(hù)劑，對樣品的作用也有很大的影響[8]。

將新鮮培養(yǎng)的單核細(xì)胞增生李斯特菌懸液，按一定的體積比添加到保護(hù)劑中混合均勻，用無菌移液器分裝至棕色西林瓶中，每瓶1 mL， 在-80 ℃冰箱中預(yù)凍8 h以上后，在0.015 mbar真空度下冷凍干燥36～48 h。然后將凍干好的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)壓蓋密封。隨機(jī)抽取8瓶樣品，對冷凍干燥前后的活菌數(shù)進(jìn)行測定，得出存活率（存活率/%=冷凍干燥后活菌數(shù)/冷凍干燥前活菌數(shù)×100）。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)菌種的鑒定

隨機(jī)挑取活化后接種到TSA-YE培養(yǎng)基的8個(gè)菌落進(jìn)行VITEK全自動生化分析鑒定，結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)菌種均為單增李斯特菌。

圖1 樣品的VITEK生化分析檢測結(jié)果

2.2 不同保護(hù)劑的滅菌和復(fù)水方式考察

對采用高壓蒸汽滅菌（121 ℃，20 min 和 115 ℃，20 min）和過濾滅菌兩種方法進(jìn)行保護(hù)劑的滅菌方法考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過濾滅菌操作耗時(shí)長，且對于部分保護(hù)劑（酪氨酸）無法充分過濾，偶爾會有樣品阻塞過濾孔的情況發(fā)生。因此，本實(shí)驗(yàn)中的保護(hù)劑優(yōu)先選擇高壓蒸汽滅菌，其中蔗糖和脫脂牛奶因不耐高溫需采用115 ℃ 滅菌20 min，其余保護(hù)劑成分均采用 121 ℃滅菌 20 min。

由于后續(xù)實(shí)驗(yàn)會將菌粉與肉粉混合配置標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品，因此考察了不同復(fù)水方法對檢測結(jié)果的影響，結(jié)果詳見表3。可見方法二的檢測結(jié)果與純菌（陽性對照）的結(jié)果一致性較高，因此，優(yōu)選方法二作為本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物的復(fù)水方法，即將肉粉樣品加入帶濾網(wǎng)的均質(zhì)袋，加入100 mL PBS 復(fù)水，經(jīng)過拍打式均質(zhì)器拍打均勻后，取清液使用平板涂布法進(jìn)行計(jì)數(shù)。

表3 不同復(fù)水方法的檢測結(jié)果 單位：CFU/mL

2.3 不同凍干條件對細(xì)菌凍干存活率的影響

將凍干機(jī)的冷凍干燥程序按照表4設(shè)置，得到凍干曲線（圖2）。在樣品溫度預(yù)凍階段-10 ℃處的波動，說明樣品的共晶點(diǎn)在-10 ℃。在升華階段樣品溫度和隔板溫度都逐漸上升，最終在解析階段樣品溫度高于隔板溫度，并趨于穩(wěn)定，證明樣品已充分凍干（凍干脫水率為90%以上）。為了縮短樣品的凍干時(shí)間，將樣品的預(yù)凍溫度設(shè)為-80 ℃，在超低溫冰箱中凍干2 h后再放入凍干機(jī)中進(jìn)行凍干實(shí)驗(yàn)，凍干程序按照表4中的第2～5步進(jìn)行。

表4 凍干程序

圖2 凍干曲線

通過采用真空壓蓋和非真空壓蓋兩種不同的壓蓋方式，考察不同的壓蓋方式對凍干樣品在不同儲存溫度下穩(wěn)定性的影響。根據(jù)圖3結(jié)果可知，非真空壓蓋的樣品在-80 ℃儲存的前3 d其保護(hù)率急速下降，并在3 d至7 d內(nèi)維持穩(wěn)定；而經(jīng)過真空壓蓋后的凍干樣品不僅在-80 ℃儲存7 d內(nèi)保護(hù)率穩(wěn)定，而且可以在4 ℃溫度條件下穩(wěn)定保存7 d。因此，經(jīng)過真空壓蓋后的凍干樣品可以滿足生物樣品冷鏈運(yùn)輸（加裝冰袋）7 d內(nèi)穩(wěn)定的基本儲存運(yùn)輸條件。

2.4 不同凍干保護(hù)劑對保護(hù)率的影響

實(shí)驗(yàn)前期初步確定保護(hù)劑為以下四種：脫脂牛奶、PVP （聚乙烯吡咯烷酮）、蔗糖 、酪氨酸 。按照保護(hù)劑正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)L9（34）的細(xì)菌凍干保護(hù)率結(jié)果見表5，采用單因素方差分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表6。因此，實(shí)驗(yàn)篩選出凍干保護(hù)率最高的保護(hù)劑配方為：50%脫脂牛奶，0.5%PVP，4%蔗糖，0.5%酪氨酸。

圖3 不同的壓蓋方式的凍干樣品在不同儲存溫度下的穩(wěn)定性

表5 凍干保護(hù)率

表6 凍干保護(hù)率單因素方差統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

2.5 不同菌體密度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在保護(hù)劑保護(hù)下的長期儲存情況

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性，是其基本性質(zhì)之一。穩(wěn)定性是指在規(guī)定的儲存環(huán)境下，在規(guī)定的時(shí)間周期內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性值保持在一定范圍內(nèi)的能力。

由于食品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)屬于生物有機(jī)體，其穩(wěn)定性通常較差，所以長期貯存條件選擇在低溫環(huán)境下，一般生物實(shí)驗(yàn)室常用的-20 ℃對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行長期的穩(wěn)定性考察。按正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇的最優(yōu)保護(hù)劑成分和冷凍干燥條件進(jìn)行低密度菌和高密度菌的凍干實(shí)驗(yàn)，凍干完成后進(jìn)行拍打均質(zhì)，獲得均勻菌粉，等量分裝低密度菌樣品和高密度菌樣品各50瓶。將樣品置于溫度設(shè)置為-20 ℃儲箱儲存，分別在不同時(shí)間各隨機(jī)選取3瓶樣品，采用單增李斯特平板計(jì)數(shù)法[4]測定低密度菌體和高密度菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的活菌數(shù)，以天為時(shí)間單位，監(jiān)測第0、3、7、15、30 d標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中活菌的保護(hù)率變化情況。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在-20 ℃穩(wěn)定性監(jiān)測結(jié)果圖（圖4）可知，在-20 ℃保存條件下的兩種菌體密度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在30 d內(nèi)活菌數(shù)目穩(wěn)定，且高密度菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保護(hù)率持續(xù)維持在30% 以上。

圖4 單增李斯特菌穩(wěn)定性監(jiān)測趨勢圖

3 結(jié)語

本文通過研究各個(gè)保護(hù)劑的滅菌方式，及復(fù)水方式對平板計(jì)數(shù)方法的操作影響，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，篩選出最優(yōu)的保護(hù)劑含量水平組合。通過研究不同凍干條件和樣品壓蓋方式，按照文中的凍干程序，并采用凍干樣品真空壓蓋，可以保證細(xì)菌凍干后保護(hù)率在30%以上。還對不同菌體密度的樣品儲存環(huán)境進(jìn)行考察，通過比較凍干菌粉的保護(hù)率發(fā)現(xiàn)，高密度菌體在-20 ℃儲存30 d穩(wěn)定。本項(xiàng)目制備的活菌在冷鏈運(yùn)輸（加冰袋）條件下7 d內(nèi)穩(wěn)定，滿足標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的發(fā)放運(yùn)輸要求，滿足實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控和方法驗(yàn)證的基本需求。本文的單核細(xì)胞增生李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究結(jié)果將為其他微生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的凍干保護(hù)方法和穩(wěn)定性研究提供理論指導(dǎo)。有助于保障量值統(tǒng)一，保證檢測結(jié)果的有效性、可比性及國際國內(nèi)互認(rèn)度[9,10]。