摻氮碳量子點對光合細菌生長過程的影響

周岳陵,岳正波,胡馥鵬,王 進

摻氮碳量子點對光合細菌生長過程的影響

周岳陵,岳正波,胡馥鵬,王 進*

(合肥工業大學資源與環境工程學院,安徽 合肥 230009)

以檸檬酸為碳源?乙二胺為修飾劑,一步水熱合成了摻氮碳量子點(N-CQDs).通過分析光合色素?蛋白質和丙二醛等生理指標,研究了N-CQDs對光合細菌生長的影響.結果表明N-CQDs抑制了的生長并呈現濃度-效應關系;光合色素分析表明N-CQDs促使菌體的類胡蘿卜素含量提高,菌綠素含量降低;光譜分析表明N-CQDs導致了胞內物質(如光合色素?蛋白質等)的泄漏.N-CQDs較強的光誘導電子轉移能力導致培養體系中產生過量自由基,自由基引發一系列脂質過氧化反應,進而導致生物膜的破裂?物質外泄和細菌衰亡.光照下N-CQDs對表現出較高的毒性.研究結果對于認識N-CQDs的光致毒性及其生態環境效應具有一定的參考價值.

摻氮碳量子點；光合細菌；光合色素；細胞毒性

近年來,隨著碳納米材料的大量開發與使用,其不可避免地被釋放到環境中,增加了生物與其接觸的機會.碳納米材料的毒性效應和環境風險受到研究者的廣泛關注[1-3].研究證實多壁碳納米管[4]?單壁碳納米管[5]和富勒烯[6]等碳納米材料對微生物和高等生物具有一定的生態毒性風險.

碳量子點(CQDs)泛指一類粒徑小于10nm,在光激發下能發熒光的新型碳納米材料.由于其光吸收和光誘導電子轉移能力以及粒徑小?水分散性良好等特性,CQDs已被證實在眾多領域具有非常好的應用前景.但是,CQDs具有豐富的表面官能團和活躍的物化特性,其進入環境后可能會對環境微生物造成負面影響,對生態系統和人類健康造成危害.因此,有必要對CQDs潛在的生物毒性和生態效應進行評估.

關于CQDs的生物毒性研究涉及的實驗對象有細胞[7-8]、細菌[9-11]、藻類[12]、斑馬魚[13]、老鼠[14]等,研究的生物種類較為有限,得到的實驗結果也不盡相同.CQDs的細胞毒性通常存在濃度依賴性,濃度越高,細胞毒性越明顯,但同種CQDs對不同類型的細胞可能表現出不同的毒性[7].Biswas等[8]也發現CQDs對不同的細菌具有不同的毒性表現.除細胞和細菌外,研究發現,CQDs對環境中的生產者藻類也具有顯著的生物毒性,當CQDs濃度達到一定數值時,通常會抑制藻類的生長及其光合作用[12].盡管有研究表明CQDs對魚類和鼠類等動物未表現出明顯的致毒效應[13-14],但對于環境中日漸增多的CQDs,其潛在的生態毒性和環境影響應當引起我們足夠的重視.

近些年來,雖然有關CQDs的生物毒性研究已廣泛開展,但對于CQDs光感特性與生物毒性之間的認識有限.考慮到CQDs的光電活性,其在光照環境下對環境微生物的影響可能更大.本文以光敏感性的常見環境微生物光合細菌()作為研究對象,探討CQDs對生長過程的影響及其潛在環境效應,從而豐富CQDs對環境微生物影響的認識,為進一步理解CQDs的生態效應以及評估其生態風險提供參考.

1 材料與方法

1.1 菌株及培養基

光合細菌()由中國科學技術大學盛國平教授饋贈.培養基為HCH培養基[15].

1.2 N-CQDs的制備

在50mL聚四氟乙烯內襯的不銹鋼反應釜中加入1.0g檸檬酸?10mL超純水以及0.3mL乙二胺,混合均勻后于200℃反應5h.自然冷卻后將反應液離心10min(8000r/min).上清液用3500Da的透析袋透析2d,得到N-CQDs儲備液,濃度為14.4mg/L(以碳計).

1.3 R. acidophila培養方案

以50mL透明玻璃瓶為反應器,培養體積為40mL.每瓶接種4mL的母液(OD660= 1.5).按照實驗設計加入N-CQDs,鼓氬氣5min后用丁基橡膠塞與鋁蓋封瓶,放置于光照培養箱(光強4500lux,32℃)靜置培養.N-CQDs添加量分別為0,1.8,3.6和7.2mg/L(以碳計).每組設定3個平行.每隔一定時間抽取菌液用于測定OD660?光合色素?蛋白質和丙二醛等生理指標.

1.4 測試方法

光合色素的提取:取5mL菌液,離心收集菌體(12000r/min,30min),5mL蒸餾水洗滌3次.菌體懸浮于5mL丙酮-甲醇(7:2,v/v)溶液中超聲浸提10min (300W,60%),離心收集上清液(12000r/min,10min).重復上述浸提過程2次,合并提取液用于光譜分析.類胡蘿卜素(Car)和菌綠素(Bchl)含量按Jessen和Beer-Lambert-Bouguer定律進行計算[16].

利用場發射透射電鏡(JEM-2100F,日本)對N-CQDs形貌觀測表征.利用紫外-可見分光光度計(UV1750,日本島津)?熒光分光光度計(F4600,日本日立)對N-CQDs和培養液進行光譜表征.培養液中蛋白質與丙二醛含量分別采用南京建成生物工程研究所的總蛋白測試盒(A045-2-2)和丙二醛測試盒(A003-1-2)測試.數據處理及分析采用Microsoft Excel 2007和Origin 8.0軟件.

蛋白質(Protein)的含量按公式(1)計算.

式中:P為樣品的Protein濃度,g/L;ODT、ODC和ODS分別為樣品?對照和標準品的OD值;S為標準品的濃度,g/L.

丙二醛(MDA)的含量按公式(2)計算.

式中:M為樣品的MDA含量,nmol/mL;ODT、ODC、ODS和ODB分別為樣品、對照、標準品和空白的OD值;S為標準品的濃度,nmol/mL;?為樣品的稀釋倍數.

2 結果與討論

2.1 N-CQDs表征

圖1a表明N-CQDs在340nm處有特征吸收峰,當激發波長為340nm時,熒光發射峰為460nm.圖1b表明N-CQDs的熒光發射與激發波長有關,表現出激發光依賴性.熒光發射峰半峰寬較小,說明粒徑分布較為均勻.TEM結果進一步證實N-CQDs粒徑小于10nm,尺寸分布均勻,顆粒分散性良好,無團聚(圖1c).

2.2 N-CQDs對R. acidophila的生長抑制

如圖2所示培養初期,N-CQD對其生長繁殖過程無顯著影響.但培養至第7d,N- CQD處理組的OD660值均低于對照組,且N-CQDs的濃度越大,OD660值越小.當培養至衰亡期(第9d)時,N-CQDs處理組的OD660值下降更快.黃淮青等[9]發現葡萄糖基熒光碳點(CDs)與調整期(2h)的酵母菌共培養時,對數期(10h)時酵母數量隨著CDs的濃度增大而減少,這與本研究的現象一致.歐陽少虎在研究氧化石墨烯(GO)和氧化石墨烯量子點(GOQD)對小球藻的毒性時發現,兩者均表現為先促后抑.在培養的前48h,這2種碳材料均促進了藻類的生長分裂,而72h后兩者表現出抑制作用[17].N-CQDs對的生長存在抑制,同時會加速細菌衰亡過程.這主要是由于納米材料在被內化的過程中,會促進親代與子代細胞壁的分裂,但經細菌內化后,可能會使菌體細胞逐漸出現結構受損?氧化應激增加?細胞代謝被干擾等不良反應,從而導致菌體的衰亡[17].

如圖2和表1所示,光照培養7d后對照組的生物量最高,各反應組生物量隨N-CQDs添加量的增大而降低,當N-CQDs濃度為7.2mg/L時,生物量下降9.2%.因此,N-CQDs對的生長過程存在抑制效果,主要體現為降低適應期的細菌基數,加速細菌衰亡,繼而使生物量降低,且這一效應存在濃度依賴現象.

圖2 N-CQDs對R. acidophila培養過程的影響

表1 培養7d時R. acidophila的干重

2.3 N-CQDs對光合色素的影響

圖3a表明各實驗組均有類胡蘿卜素(Car)和菌綠素(Bchl)吸收峰,說明N-CQDs并未影響中光合色素的種類.圖3b表明Car含量隨N-CQDs濃度的增大而增加,而Bchl含量則隨N-CQDs濃度的增大而降低.Car作為一類輔助色素,能夠捕獲和傳遞光能,還可以保護光化學反應中心,防止光損傷與自由基氧化.研究表明,鹽藻和雨生紅球藻在響應環境脅迫時,會合成和積累大量類胡蘿卜素[18-20].本研究中Car含量增加是自身對N-CQDs脅迫的響應.Bchl作為光化學反應的主要色素,其含量與活性影響到細菌的生長代謝過程.環境脅迫將破壞光合作用系統,致使葉綠素含量不斷下降[21].細胞內的高氧化應激壓力也會影響生物體內葉綠素a的合成[22].環境逆境下,細胞體內產生的多種活性氧(H2O2,O2-,-OH*,1O2*等)會導致機體的氧化損傷[23],并且葉綠體是主要的靶器官[24].歐陽少虎[17]發現GOQD會引起小球藻葉綠素a含量降低,他認為可能是GOQDs抑制了葉綠素的合成.而本研究中,Bchl含量的降低,可能是N-CQDs破壞了光化學反應中心的結構,導致Bchl的流失和分解.光合色素分析結果表明N-CQDs對表現出脅迫作用,而細菌通過合成Car來削弱此作用.

2.4 培養液光譜分析

2.4.1 紫外-可見吸收光譜 對照組的初始培養液無特征吸收峰,而N-CQDs處理組則在340nm處出現特征峰.培養12d,各實驗組于390nm處出現一個強吸收峰,且在500nm~600nm間有4個吸收峰,這些吸收峰與活細胞光譜的主要吸收峰相對應(圖4a),可能是色素泄漏造成的.程茜茹等[25]發現沼澤紅假單胞菌的Bchl在光照下容易降解為一種相對穩定的中間物質,該物質在390nm處具有強吸收峰.N-CQDs處理組上清液中390nm處的吸收強度隨N-CQDs濃度的增大而增大,說明Bchl的降解加劇.而Bchl的降解通常涉及到羥基自由基以及脂質過氧化物[21].N-CQDs可能引起了過度的脂質過氧化反應,導致細胞膜的損傷,致使更多的胞內物質(如Bchl a)泄漏到培養基中.而Bchl降解產物的增多,可能是處理組Bchl含量偏低的原因之一.

2.4.2 三維熒光光譜 圖5為對照組和添加7.2mg/ L的N-CQDs處理組不同時期培養液的三維熒光光譜分析結果.培養第3d,對照組培養液出現新的熒光峰(ex/em=400/465nm)(圖5b),此峰為聚羧酸類腐殖酸物質,說明此時對照組代謝旺盛.而處理組中N-CQDs峰(ex/em=350/450nm)迅速消失,說明N-CQDs能夠被細菌吸附或內化.這可能是由于N-CQDs粒徑小于10nm,極易被內化進入菌體內.但此體系中并未出現ex/em=400/ 465nm熒光峰(圖5f),說明N-CQDs處理組細菌的代謝可能受到限制.N-CQDs處理組第3d檢測到色素的熒光峰(ex/em=390/615nm和ex/em=390/675nm) (圖5f).這說明胞內色素發生外泄,光反應中心可能遭到破壞[26].培養至第7d,對照組未檢測到的色素熒光峰,表明其生長狀態良好,物質外流較少;而N-CQDs處理組中的色素熒光峰進一步增強,說明胞內物質在持續泄漏.

至第12d,細菌進入衰亡期,各實驗組中均檢測到色素熒光峰(圖5d和h).表2顯示隨著N-CQDs的濃度增加,細胞色素的熒光峰強度相應增大,進一步證明N-CQDs處理組的細菌衰亡程度更嚴重.熒光光譜分析結果表明光照培養下N-CQDs對存在脅迫作用,并且整個生長過程一直存在細菌胞內物質的持續泄漏.因此,N-CQDs對的損傷是一個持續的過程.

表2 色素熒光特征峰的強度

圖5 不同時刻培養液的三維熒光光譜圖

2.5 N-CQDs對培養液中蛋白質和丙二醛的影響

圖6 培養液中的蛋白質和丙二醛含量

丙二醛(MDA)是細胞膜脂質過氧化反應的產物,其含量變化能夠反映細胞膜脂質的過氧化程度.脂質過氧化反應會持續引發細胞膜的損傷,進而產生不可逆的破壞,導致細胞死亡,胞內物質外泄[27].培養液中蛋白質和丙二醛的含量均隨N-CQDs濃度的增大而增高(圖6).蛋白質的大量外泄表明N- CQDs導致了菌體細胞膜的受損[28-29].Travlou等[30]研究氮摻雜CQDs的抗菌活性時發現,氨基和酰胺基在水溶液中的質子化會使N-CQDs與細菌脂質膜發生靜電相互作用,從而破壞細胞膜.N-CQDs的氮元素摻雜可能加劇了CQDs的毒性.當添加7.2mg/L的N-CQDs時,實驗組的MDA含量為對照組的2.3倍.張倩[31]在研究碳納米材料的毒性作用時,檢測到氧化石墨烯(GO)暴露下的微藻的丙二醛含量的顯著升高,發現GO能夠誘導氧化脅迫,造成微藻細胞的膜脂質過氧化.MDA含量的變化也能夠間接反應機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度.由于氨基和酰胺基的強給電子能力,N-CQDs能夠誘發大量活性氧(O2-、OH-、HO2-)的產生[30].這些活性氧會導致的氧化損傷,從而對脂質?蛋白質?核酸等造成損害,最終導致細胞死亡.

2.6 N-CQDs對R. acidophila的毒性分析

本研究發現N-CQDs對光合細菌的毒性存在濃度依賴性.培養7d時1.8,3.6,7.2mg/L的N-CQDs使得生物量分別下降了1.1%,5.2%和9.2%(表1).其中生物量抑制率(%)與N-CQDs濃度(mg/L)存在線性相關關系(2=0.97).董微等[32]研究也發現碳量子點對酵母菌的毒性表現出濃度依賴性.雖然碳量子點已被證實具有細胞毒性,但大部分研究表明碳量子點的毒性較小.當細胞抑制率(活力或數量)為10%時,碳量子點的濃度通常大于38mg/L(表3).而本研究中,當N-CQDs的濃度為7.2mg/L時,其對的抑制率已達到9.2%.因此,在光照下,N-CQDs可能表現出較高的毒性.

表3 碳量子點的細胞毒性

CQDs具有優良的光電性質,既能作為電子供體也能成為電子受體.在持續光照下,CQDs通常會產生光生電子-空穴對,形成的空穴和電子被分離且分別遷移到CQDs表面,能夠將吸附在其表面的羥基和水分子氧化成羥基自由基(·OH),這些小分子具有很強的氧化能力,可以破壞或者降解有機物.研究表明CQDs能夠促進羥基自由基和超氧自由基的生成[40-43].這些自由基容易攻擊細胞膜上的多不飽和脂肪酸,造成脂質過氧化,導致細胞膜失去功能.同時能夠直接和蛋白質?核酸等作用,導致細胞的病變或死亡.Biswas等[8]發現石墨烯量子點(GQDs)暴露下細菌出現物理損傷以及明顯的氧化應激行為.本研究中當N-CQDs被添加到培養基中,在光照下,體系內會持續產生大量的自由基,從而引發一系列脂質過氧化反應,丙二醛含量隨N-CQDs的濃度增大而增高.而膜結構中豐富的多不飽和脂肪酸分子,有利于脂質過氧化鏈式反應的發生,這些連鎖反應對細胞膜造成大量的損傷,最終破壞膜的完整性,導致大量膜蛋白和胞內色素的泄漏.N-CQDs對環境微生物的脅迫作用和光致毒性等,值得進一步關注.

3 結論

以檸檬酸和乙二胺為原料水熱合成制得粒徑小于10nm發藍色熒光的N-CQDs.N-CQDs對光合細菌的生長具有氧化脅迫作用,因此抑制了其生長過程并導致胞內蛋白及光合色素等泄漏.添加7.2mg/L的N-CQDs對的生物量抑制率達9.2%,反映細胞膜脂質過氧化反應的MDA濃度則是無添加對照組的2.3倍.

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[41] Di J, Xia J, Chen X,et al. Tunable oxygen activation induced by oxygen defects in nitrogen doped carbon quantum dots for sustainable boosting photocatalysis [J]. Carbon, 2017,114:601-607.

[42] Sharma S, Umar A, Mehta S K,et al. Solar light driven photocatalytic degradation of levofloxacin using TiO2/Carbon-dot nanocomposites [J]. Chemical Engineering Journal, 2018,42(9):7445-7456.

[43] Zhang J, Yan M, Yuan X,et al. Nitrogen doped carbon quantum dots mediated silver phosphate/bismuth vanadate Z-scheme photocatalyst for enhanced antibiotic degradation [J]. Journal of Colloid and Interface Science, 2018,529:11-22.

致謝：光合細菌由中國科學技術大學盛國平教授饋贈,在此表示感謝.

Effect of nitrogen-doped carbonquantum dots on the growth of photosynthetic bacteria.

ZHOU Yue-ling, YUE Zheng-bo, HU Fu-peng, WANG Jin*

(School of Resources and Environmental Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)., 2019,39(8)：3396~3403

Nitrogen-doped carbon quantum dots (N-CQDs) were formed by one-step hydrothermal synthesis, using citric acid as carbon source and ethylene diamine as modifierin this study. The effects of N-CQDs on the growth of photosynthetic bacteriawere investigated by analyzing the physiological indexes of photosynthetic pigment, protein and malondialdehyde. The results showed that N-CQDs inhibited the growth ofand showed a concentration-effect relationship. Additionally, N-CQDs increased the content of carotenoid inwhile it decreased the content of bacteriochlorophyll. Furthermore, spectra analysis results showed that N-CQDs led to the leakage of intracellular sbustances such as photosynthetic pigment and protein. The strong light-induced electron transfer ability of N-CQDs resulted in excessive free radicals in the culture system of, which led to a series of lipid peroxidation reactions, which in turn led to the rupture of biofilms, material leakage and bacterial death. N-CQDs had a high toxicity onunder light. The results of this study are valuable for understanding the phototoxicity and ecological effects of N-CQDs.

N-CQDs；photosynthetic bacteria；photosynthetic pigment；cytotoxicity

X171.5

A

1000-6923(2019)08-3396-08

周岳陵(1994-),男,湖南衡陽人,碩士研究生,主要研究方向為環境生態修復.發表論文1篇.

2019-02-20

國家自然科學基金資助項目(41772361);中央高校基本科研項目(JZ2017YYPY0246)

* 責任作者, 教授, sophiawj@hfut.edu.cn